흰쥐의 임신자궁에서 cyclic nucleotide phosphodiesterase 동종효소의 특성과 역할

Abstract

[한글]

임상적으로 현재 조기진통의 억제에 사용하는 약물로는 아드레날린성 효현제, magnesiu

m sulfate, alcohol 등이 있지만 모체나 태아에 부작용을 일으킬 수 있으므로 사용시에

상당한 주의가 필요하다. 최근 부작용이 적고 작용기전이 새로운 약물로서 cyclic nucleo

tide phosphodiesterase (PDE) 억제제, prostaglandin 합성 억제제, 칼슘통로 봉쇄제 등

이 시도되고 있다.

PDE는 세포내의 cAMP 분해를 촉매하는 효소로 평활근의 이완에 관여한다. 거의 모든 조

직이나 세포에는 기질 특이성 (substrate specificity), 물리적 성질, 조절 기전이 서로

다른 PDE 동종효소가 존재한다고 알려져 있다. 이에 본 연구는 흰쥐에서 임신중 자궁평활

근의 PDE 동종효소의 변화를 관찰하고 그 조절물질들을 확인한 다음, 자궁평활근에 대한

선택적 PDE 억제제의 효과를 검색하고 조기진통의 억제에 기여하는 PDE 동종효소의 특성

을 규명하고자 하였다.

실험동물로는 동물실 환경에 1주일 이상 적응시킨 몸무게 220 ∼ 300g의 암컷 흰쥐(Spr

ague-Dawley rats)를 사용하였다. 실험은 흰쥐를 비임신군, 임신중기군, 임신말기군의 세

군으로 나누어 실시하였다. 비임신군은 estradiol (15㎍ /0.1ml /100g, i.p.)을 처치하

여 이틀째 되는 날, 임신중기군은 임신시킨 지 11일 후, 임신말기군은 임신시킨 지 21일

후에 각각 경부전위 (cervical dislocation)로 희생시켰다. 적출 자궁평활근의 자발운동

에 대한 약물의 효과를 보기 위하여 적출한 즉시 사용하였으며, ehromatography에 의해 P

DE 동종효소를 분리하기 위해서는 적출한 자궁평활근을 -70℃ deep freezer에 보관한 뒤

사용하였다.

PDE 동종효소를 분리하기 위해서는 deep freezer에 보관한 자궁평활근의 시료를 꺼내어

Polytron으로 균질화한 후 균질액을 40,000 rpm에서 1시간 동안 초원심분리하여 세포막

분획 (particulate fraction)과 세포질 분획 (cytosol fraction)으로 분리하였다. 이 세

포질 분획을 가지고 Q Sepharose Fast Flow chromatography를 실시하였다. 그리고 PDE 활

성은 cAMP 및 cGMP를 기질로 사용하여 측정하였다.

자궁평활근의 자발운동에 대한 약물의 효과를 보기 위해서 적출한 자궁평활근의 전충표

본 (2mm x 5mm)을 15ml의 Tyrode액이 담긴 용기에 넣어, 그 운동을 force displacement t

randucer를 통하여 Polygraph(Model 7, Grass Instrument Co., Quincy, MA, USA)에 기록

하였다.

실험결과는 다음과 같다.

1. 비임신군에서는 cAMP (또는 cGMP) PDE 활성이 자궁평활근 세포질에 74% (88%), 세포

막에 26% (12%)이던 것이 임신기간중 자궁평활근 세포질의 동종효소 활성이 점차 증가하

여 임신말기군에 이르면 세포질에 84% (73%), 세포막에 16% (7%)가 되었다.

2. 비임신군에서 가장 활성이 높던 typeⅣ 동종효소가 임신중기군부터 없어져 나타나지

않았다.

3. 비임신군에서는 존재하지 않던 typeⅡ 동종효소가 임신중기군부터 나타났다.

4. 비임신군에서는 활성이 낮던 typeⅢ 동종효소가 임신중기군부터 활성이 높아져 주동

종효소가 되었다.

5. TypeⅠ 및 Ⅱ 동종효소의 경우 임신중기군부터 cGMP/cAMP PDE 활성비가 감소하였다.

6. 임신중기군부터 나타난 typeⅡ 동종효소의 경우 임신말기군에 이르러 cGMP/cAMP PDE

활성비가 감소되었다.

7. TypeⅢ 동종효소 억제제인 milrinone에 의하여 임신중기 이후의 자궁평활근 수축이

현저하게 억제되었다.

8. TyperⅤ 동종효소 억제제인 Ro2O-1724 및 typeⅤ 동종효소 억제제인 dipyridamole에

의한 자궁평활근 이완효과는 임신중기 이후에 있어서 milrinone의 효과에 비하여 약하게

나타났다.

이상의 성적으로 보아 조기진통의 억제에 사용가능한 약물로는 임신중기 이후의 주 동

종효소인 typeⅢ 동종효소의 선택적 억제제가 가장 유망할 것으로 사료된다.

[영문]

Tocolytic agents that are currently in clinical use include β- adrenergic

agents, magnesium sulfate and ethanol. Recently, new classes of pharmacological

agents, including prostaglandin synthesis inhibitors, calcium channel blockers, and

cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) inhibitors, have been proposed as

tocolytic agents and currently undergoing critical evaluation.

PDE, which catalyzes the breakdown of cAMP in the cells, is involved in the

relaxation of the smooth muscle. It is known that several types of isozymes which

differ in substrate specificity, physical properties, regulation mechanism, etc.

are present in most of the tissues and cells studied. In an effort to search for a

new tocolytic agent, the changes and the characteristics of PDE isozymes during

pregnancy were studied in the present study.

Female Sprague-Dawley rats weighing 220 to 300g were used in all experiments. The

animals were divided into three groups: control (non-pregnant), mid-term (11th day

of pregnancy) and near-term (21st day of pregnancy). Control rats received

estradiol (157㎍/0.1m1/100 body wt.,i.p.) for two days. The animals were sacrificed

by cervical dislocation and the uteri were removed and used right away to determine

the effects of PDE inhibitors on the spontaneous uterine movement. For the

separation of PDE isozymes the uterus samplers were stored in -70℃ freezer. The

frozen uteri were homogenized and centrifuged 40,000 rpm (105,000 x g) for 1 hr.

The PDE isozymes present in the supernatant fraction were separated on a Q

Sepharose Fast Flow column.

The PDE activities were determined using cAMP and cGMP as substrates.

To observe the effect 7f drugs on the spontaneous uterine motility, the iaolated

uterine strip (27m x 57m) was suspended in a chamber containing 15ml of Tyrode

solution, and the motility was recorded on a Polygraph through the force

displacement transducer.

The results of the present study are summarized as follows :

1. In the non-pregnant rats CAMP PDE (or cGMP PDE) activities in the membrane and

cytosol fractions were 74% (88%) and 26% (12%), respectively. As the pregnacy

proceeds, the PDE activities in the cytosol tend to be increased, and near the

term, the cAMP PDE (or cGMP PDE) activities in the membrane and cytosol fractions

were 84% (93%) and 16% (7%),respectively.

2. The type Ⅳ isozymes, whose activities were highest In the non-pregnant rats,

disappeared at and following the midterm of pregnancy.

3. The type Ⅱ isozymes, whose activities were not present in the non-pregnant

rats, began to appear near the midterm of pregnancy.

4. The type Ⅱ isozymes, whose activities were very low in the non-pregnat rats,

became the major one at and following the mid term 7f the pregnancy.

5. The cGMP/cAMP PDE activity ratios of the types Ⅰ and Ⅲ were decreased at the

midterm and maintained at that level for the rest of pregnancy period.

6. The cGMP /cAMP PDE activity ratio of the type Ⅱ, whose activities were not

present in the non- pregnant rats, decreased as the pregnancy proceeds.

7. The contractility of pregnant uterine muscle was markedly decreased compared

to that of the non-pregnant by milrinone, a type Ⅲ isozyme inhibitor.

8. No remarkable inhibition of uterine contraction by both Ro2O-1724 and

dipyridamole, a type Ⅳ isozyme inhibitor and a type Ⅴ isozyme inhibitor

respectively, was shown since midterm of pregnancy comparing with the effect of

milrinone.

From these results it is suggested that the specific inhibitors of the type 111

isozyme, which is the major one at and following the midterm of pregnancy, are the

most premising candidate for the treatment of premature labor.