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백서 간장에서 고함수탄소 식이에 의한 ATP-Citrate Lyase 함량 및 그 전사활성 조절

Other Titles
 Regulation of ATP-citrate lyase content and transcription activity in liver of rat by high carbohydrate diet 
Issue Date
1991
Description
의학과/박사
Abstract
[한글] ATP-citrate Iyase(EC 4.1.3.8, ACL)는 ATP 존재하에 citrate와 coenzyme A(CoA)가 반 응하여 oxaloacetate와 acetyl CoA를 생성하는 반응을 촉매하여 세포질에서 지방산 및 ch olesterol 생합성에 필요한 acetyl CoA를 공급하는 효소이다. 간장세포나 지방세포에서 이 효소의 활성도 및 양은 식이, hormone 등에 의하여 조절되며 세포의 분화와 성장단계 에 따라 그 표현(expression)이 조절된다고 보고되어 있다. 그러나 현재까지 포유동물의 간장내에서 이 효소의 생합성 및 축적에 대한 분자생물학적 기전은 밝혀져 있지 않다. 본 실험에서는 72시간 금식시킨 백서에 고함수탄소 식이를 자유롭게 먹게 한 후 시간 변화에 따라 간장세포질내 ACL 단백질의 양, ACL mRNA의 양, 핵내에서의 ACL 유전자 전사 활성을 측정하여 이들의 상호관계를 구명하고자 하였다. 백서 간장의 poly(A** +) RNA로 부터 cDNA를 합성하고 polymerase chain reaction 방법으로 전체 ACL cDNA 중 550번째부 터 2103번째 염기부위의 약 1.55 kb 크기의 cDNA를 증폭하여 plasmid vector에 subclonin g하였다. 이 cDNA를 여러가지 제한효소로 절단하여 restriction map을 확인하였으며, 이 clone을 ACL에 대한 probe로 사용하였다. 백서에 고함수탄소 식이를 투여한 후 간장세포질내 ACL 단백질 양은 8시간부터 급격히 증가하기 시작하여 48시간까지 계속적으로 증가되고 있었다. 또한 세포질내 ACL mRNA의 양은 약 6시간 후부터 증가되었으며 12시간에 급격히 증가하여 최고를 나타내었다. 그러 나 12시간에서 24시간 사이에 ACL mRNA는 점차 감소되어 24시간과 48시간에는 거의 나타 나지 않았다. 즉 24시간까지 ACL 단백질의 양적 증가 현상은 ACL mRNA의 양적 변화와 일 치하여 증가되었으나 24시간에서 48시간 사이에는 ACL mRNA는 상당히 감소되어 있는 반면 에 ACL 단백질은 현저하게 증가되어 있었다. 핵내에서의 ACL 유전자의 전사활성은 고함수 탄소 식이 투여 후 4시간부터 증가되어 probe로 사용한 plasmid에 따라 증가되는 signal 의 강도에 차이가 있었으며 pGACL2의 경우 12시간에는 약 24배 증가되어 최고치에 달했으 며 식이 투여 후 48시간에는 약 16배 증가되어 있었고, pGACLl의 경우 식이 투여 후 12시 간에 약 13배 증가되어 최고치에 달했으며 48시간에 약 5배 증가되어 있었다. 즉 핵내에 서의 ACL 유전자 전사활성은 세포질내 ACL mRNA의 증가보다 4시간 선행하여 증가하였으며 세포질내 ACL mRNA의 양은 식이 투여 후 24시간에 급격히 감소된 반면 핵내 전사활성은 24시간이후 48시간까지 계속 증가된 상태를 유지하였다. 이상의 결과로 보아 백서를 금식시킨 후 저지방 고함수탄소 식이를 투여한 경우 백서 간장에 ACL이 양적으로 증가하는 현상은 일차적으로 백서 간장세포질내 ACL mRNA의 양적 증가와 연관이 있으며 세포질내 ACL mRNA의 양적증가는 핵내에서의 ACL 유전자 전사활성 증가에 기인한 것으로 사료된다. 그러나 이들 상호간의 양적증가 현상의 시간적인 차이점 은 ACL 효소의 증가현상이 단지 ACL 유전자 전사활성 증가에 의한 ACL mRNA 증가 때문만 이 아니고 전사 이후 단계에서 또 다른 조절 기전이 부가적으로 작용하고 있음을 시사한 다.
[영문] ATP-citrate lyase(EC 4.1.3.8, ACL) is an enzyme that catalyzes the reaction between CoA and citrate to produce acetyl CoA required for the biosynthesis of fatty acids and cholesterol in the cytoplasm. Although it has been reported that the activity and the amount of ACL are regulated by diets and hormones, the precise molecular mechanism of the biosynthesis and accumulation of the enzyme in mammalian liver is not known yet. In the present study, rats fasted for 72 hours were refed a high carbohydrate diet ad libitum and the amount of ACL protein, ACL mRNA in the liver cytosol and the activity of ACL gene transcription in liver nuclei were measured in order to identify the relationship between them. A 1.55 kb ACL cDNA comprising the sequence between 550 and 2,103 basses was amplified by polymerase chain reaction from poly(A**+ ) RNA in rat liver, inserted into plasmid vector and cloned in E. coli. The restriction map of the cDNA was confirmed by the fragments appeared upon the digestion with the restriction enzymes and the cDNA was used as a probe for ACL. The amount of ACL protein in liver cytosol of rats refed a high carbohydrate diet began to increase at 8 hour after refeeding followed by a continuous increase until 48 hours, but ACL mRNA content in cytosol began to increase at 6 hour after refeeding the diet, and then rapidly increased at 12 hour after refeeding the diet to reach a maximum value. A rapid decrease in ACL mRNA was observed at 15 and 24 hours followed by a disappearance at 24 and 48 hours after refeeding a high carbohydrate diet. The increase of ACL protein content until 24 hours after refeeding the diet accompanied with the increase of ACL mRNA content, however, ACL mRNA content at 24 and 48 hours after refeeding the diet was remarkably decreased with an increased ACL protein content. The activity of ACL gene transcription in nuclei of rat liver began to increase at 4 hours after refeeding a high carbohydrate diet with the different intensities according to the kind of probe used. A 24 fold increase in ACL transcription at 12 hours followed by a 16 fold increase in it at 48 hours after refeeding the high carbohydrate diet was observed when pGACL2 was used as a probe, while about 13 fold increase at 12 hours followed by a 5 fold increase at 48 hours after refeeding the diet was observed when pGACLl was used as a probe. The activity of ACL gene transcription in nuclei and the amount of ACL mRNA in cytosol were rapidly increased and ACL mRNA content in cytosol was rapidly decreased at 24 hours after refeeding the high carbohydrate diet while the activity of ACL gene transcription in nuclei maintained a constant high level at 24 and 48 hours after refeeding the diet. From these results, it is concluded that the increase of ACL content in liver of the fasted rat refed the low fat-high carbohydrate diet is related primarily to the increased amount of ACL mRNA in cytosol in the early phase of dietary induction due to the increased activity of ACL gene transcription in nuclei and that the time course difference between these increases may be the consequences of not only a ACL mRNA increase but also a posttranscriptional regulation mechanism.
URI
http://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/115412
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2. 학위논문 > 1. College of Medicine (의과대학) > 박사
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