백서의 폐조직에서 분리한 미세혈관 내피세포의 배양 및 동정

Abstract

[한글]

혈관 내피 세포가 관여하는 것으로 알려진 동맥 경화, 당뇨병성 미세 혈관병증 등 여러

질환의 병리 기전과 종양의 혈행성 전이 과정 중 혈관 내피세포와 종양 세포간의 상호

작용기전등에 대해서는 많은 관심과 노력에도 불구하고 확실히 밝혀진 것이 없다. 이처럼

연구에 어려움이 따르는 가장 큰 이유는 혈관 내피세포를 시험관내에서 배양하기가 어렵

기 때문이며, 그 중에서도 특히 미세혈관 내피세포의 배양은 직경이 큰 혈관의 내피세포

에 비하여 배양 조건이 훨씬 까다롭다. 본 연구는 미세혈관 내피세포를 시험관 내얘서 배

양시킬 수 있는 방법을 정립하고 세포의 기질, 배지내 혈청의 유무등이 미세혈관 내피세

포의 증식에 미치는 영향을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

백서의 폐에서 얻은 세포와 이식편들을 1 % 젤라틴으로 처치한 후 24 well 세포 배양판

에 분주하고 혈관 내피세포 증식 보강제 및 여러 발육 인자, 영양분등을 첨가한 무혈청

배지에서 배양하였다. 배양 7일에서 10일 사이에 다각형, 또는 조약돌 모양의세포들에 의

하여 단층이 형성되었다. 이들 세포는 서로 촘촘하게 결합된 양상을 보였으며 형태학적으

로 전형적인 미세혈관 내피세포의 특징을 나타내었다. 보다 정확한 동정을 위하여 혈관

내피세포에 특이한 factor VⅢ-related antigen의 유무를 면역 화학적 방법에 의하여 조

사한 결과, 양성을 보임으로써 배양된 세포가 미세혈관 내피세포임을 확인하였다. 세포의

기질이 미세혈관 내피세포의 시험관내 증식에 미치는 영향을 알아보고자 젤라틴처리 배

양판과 처리하지않은 배양판에서 각각 미세혈관 내피세포를 배양시켜 관찰한 결과, 젤라

틴으로 처리한 배양판애서 더 빠른 세포 증식속도를 보였으며, 젤라틴을 입히지 않은 세

포들은 factor VⅢ-related antigen 음성이었다. 한편 배지내 혈청의 유무와 미세혈관 내

피세포의 선택적 증식과의 관계를 관찰한 결과, 혈청이 포함된 배지을 사용한 경우에는

미세혈관 내피세포 대신에 섬유아세포로 생각되는 t[포의 증식이 관찰되었고, factorVⅢ-

related antigen도 음성이었다. 즉, 미세혈관 내피세포의 선택적 증식을 위해서는 젤라틴

으로 처리된 배양판과 무혈청 배지의 사용이 필요함을 알 수 있었다. 무혈청 배지에 의하

여 일차 배양에서 단층을 형성한 미세혈관 내피세포의 이차 배양은 Oulbecco's modificat

ion of Eagle's medium(DMEM)과 Ham's F l2 medium이 1:1로 혼합된, 20%의 우태아 혈청이

포함된 배지을 사용하였으며 배양 4일에서 5일 사이에 미세혈관 내피세포에 의한 단층이

형성되었다.

[영문]

Since the first reports of Jin vitro culture of vascular endothelium, most

successes have been achieved with endothelial cells derived from large vessels such

as human umbilical vein rind bovine aorta. Many authors have investigated

adherence, chemotaxis, extravasation and intercellular interactions of various cell

types, like neutrophils, lymphocytes, and tumor cells in contact with large vessel

endothelial cells. However, it has become clear that there are many fundamental

differences between microvascular endothelial cells and large vessel endothelial

cells. Thus, the inferences that haute been made about the mechanisms of

angiogenesis, inflammation, and tumor metastasis based on a study of large vessel

endothelium may not be valid.

In vitro culture of microvascular endothelium remains a difficult procedure

because of the difficulty of obtaining pure population of micmvascular endothelial

cell in primary cultures and the difficulty of satisfying their fastidious culture

requiremcnt. In this report the isolation, cultivation, identification and growth

pattern of microvascular endothlium from rat lunge arc described.

Cells and explants derived from rat lungs were plated on 1% ge1atin coatod

culture plate and cu1tured with serum-free media containing endothelial ce11 growth

supplement, epidermal growth factor, insulin, hydrocortisone and so on. Five to

seven days afar plating, cultured cells demonstated a homogencous population with

features characteristic of cndothelium, namely they formed a monolayer of flats

polygonal cells with round or oval nuclei contains several nucleoli. Identification

of these cells was also performed by immunocytochemical method for factor

VⅢ-related antigen and they expressed factor VⅢ-related antigen on virtually 100%

of cells. Therefore, the cultured cells were identified as endothelial cells by

their morphology and by positive stain for factor VⅢ-related antigen.

Differences between gelatin coated culture plate and uncoatod culture plate in

endothelial cell growth were evaluated. Cells plated on uncoated platic plate had a

spindle shaped morphology and did not express factor VⅢ-related antigen.

Serum-free media containing endothelial cell growth supplement and RPMI 1640 media

supplemented with 10% fetal calf serum were also compared in primary culture. In

contrast with serum-free media, cells cultured in serum-contains media showed

fibroblast-like morphology, and these fibroblast-like cells did not express factor

VⅢ-related antigen. These results suggest that a gelatin substratum and serum-free

media containing endothelial cell growth supplement are necessary for the in vitro

proliferation of microvascular endothelial cells.

The cu1ture method and conditions outlined herr allows the proliferation of pure

microvascular endothelial cells and may be useful for the studies of inflammation,

angiogensis, metastanisms, and the role of microvascular endothlium in other

pathologic states.