Detection of low level somatic mutation in pediatric epilepsy and genotype-phenotype correlation

Abstract

Epilepsy is a neurological disorder characterized by unprovoked seizures. Around one-third of epilepsy patients have intractable epilepsy, or drug resistant epilepsy (DRE). Recent studies have identified that somatic variants in the brain can cause focal malformations, which are linked to DRE. Although many somatic mutations have been identified, their detection requires extensive analysis of brain tissue and blood samples. Even with such efforts, some samples have low variant allele frequencies (VAFs) that may be considered mutation-negative. Furthermore, the clinical features of patients with these somatic mutations remain poorly understood. The purpose of our study was to investigate the clinical phenotypes of a large cohort of patients with intractable epilepsy who underwent epilepsy surgery. We aimed to detect somatic mutations in tissues previously deemed mutation-negative, and compare efficacy of mutation detection in brain tissue alone versus paired brain-blood samples. Our study focused on pediatric patients with drug-resistant epilepsy who underwent surgery in a tertiary epilepsy center from 2004 to 2022. We performed deep sequencing on both brain tissues alone and paired with peripheral blood samples. Among 238 patients who underwent epilepsy surgery and had brain tissues evaluated for genetic variants, we identified somatic mutations in six genes (MTOR, SLC35A2, PIK3CA, TSC1, TSC2, AKT3) in 65 patients and germline mutations in the DEPDC5 or NPRL3 genes in 15 patients. We could detect the same variant in both brain-only and matched brain-blood studies. In detecting the somatic mutations, we identified somatic mutations of the SLC35A2 gene in two patients whose brain tissues had very low VAFs. We used fluorescence activated nuclei sorting to extract nuclei with specific genetic activities, thereby enhancing the VAF. Among the 80 patients, the most frequent histopathologic findings in the brain tissues were focal cortical dysplasia types IIa (FCDIIa) and IIb (FCDIIb). Brain samples in patients with MTOR mutations predominantly showed FCDIIa and FCDIIb, while brain tissues in patients with SLC35A2 mutations frequently presented mild malformation of cortical development with oligodendroglial hyperplasia in epilepsy. Patients with identical nucleotide mutations exhibited different pathologies, suggesting genotype-phenotype heterogeneity. By analyzing a large cohort, we were able to provide a comprehensive clinical profile of patients with somatic or germline mutations with intractable epilepsy. Our findings suggest that examining brain tissue only can be as effective as paired brain-blood testing for detecting genetic mutations. As methods for identifying low-VAF mutations evolve, we anticipate advancement in the genetic characterization of patients with intractable epilepsy, discovery of targeted therapies in genetic epilepsy and better patient outcomes.

뇌전증은 비유발 경련을 특징으로 하는 신경학적 질환이다. 뇌전증 환자들의 약 30%는 난치성 뇌전증, 즉 약물 저항성 뇌전증으로 치료받는다. 최근 연구상 뇌의 체성 변이는 국소 발달 장애를 일으킬 수 있으며, 이는 약물 저항성 뇌전증과 관련이 있음이 밝혀졌다. 많은 체성 변이가 확인되었지만, 이른 검출하려면 뇌 조직과 혈액 샘플에 대한 광범위한 분석을 요한다. 이러한 과정 후에도 일부 조직은 변이 대립 유전자 빈도(VAF)가 낮아 돌연변이가 발견되지 않기도 한다. 나아가, 이러한 체성 돌연변이가 있는 환자들의 임상적 특징에 대해서는 정보가 부족한 상태이다. 본 연구는 뇌전증 수술을 받은 난치성 뇌전증 환자의 대규모 코호트에서 임상적 표현형을 조사하고자 하였다. 연구진은 기존에는 돌연변이 음성으로 간주된 조직에서 체성 돌연변이를 탐지하고, 돌연변이를 탐지함에 있어서 뇌 조직 단독 검사와 뇌-혈액샘플 양측 검사에서의 효용을 비교하고자 하였다. 연구 대상은 단일 삼차 뇌전증 기관에서 약물 저항성 뇌전증을 진단받고 2004년부터 2022년까지 수술을 받은 소아청소년 환자들이었다. 본 연구진은 심층 염기서열 분석을 뇌 조직 단독 분석 및 뇌 조직과 말초 혈액 샘플의 맞춤 분석 두가지로 수행을 하였다. 본 연구진은 국소 뇌 발달 장애가 확인된 238명의 환자들 중 65명의 환자들에서 6개 유전자(MTOR, SLC35A2, PIK3CA, TSC1, TSC2, AKT3)의 체성 변이를 확인하였으며 15명의 환자들에서 DEPDC5 또는 NPRL3 유전자의 배선 돌연변이를 확인하였다. 본 연구에서는 뇌 단독 분석과 뇌 조직-말초 혈액 맞춤 분석 두 검사 모두에서 같은 체성 변이를 검출할 수 있었다. 또한 VAF가 매우 낮아 이전에는 돌연변이 음성으로 확인된 두 환자들을 대상으로 SLC35A2 유전자의 체성 변이를 확인하였다. 연구진은 형광 활성화 핵 분류 기법을 통해 특정 유전적 활동이 있는 핵을 추출하여 VAF를 향상시켰다. 환자 80명의 뇌조직에서 가장 흔하게 확인된 조직병리 소견은 국소 피질 이형성IIa형(FCDIIa)과 IIb 형(FCDIIb)이었다. MTOR 유전자 돌연변이가 있는 환자의 뇌조직은 주로 FCDIIa, FCDIIb 소견이었으며, SLC35A2 유전자 돌연변이가 있는 환자의 뇌조직에서는 과립교세포 과형성을 동반한 경미한 피질발달장애 소견을 주로 보였다. 동일한 염기서열 돌연변이가 확인된 환자들에서도 다른 조직병리를 보이는 경우가 있었으며, 이는 유전형-표현형 이질성을 시사한다. 본 연구에서는 대규모 코호트를 분석하여 난치성 뇌전증이 있는 환자들 중 체성 또는 배선 돌연변이가 있는 환자들의 임상적 양상을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과는 체성 변이 검출에 있어서 뇌 조직 단독 분석이 뇌 조직-혈액 샘플 맞춤 분석과 비슷하게 효과적임을 제시한다. 저단계 체성 변이를 식별하는 방법이 발전함에 따라 난치성 뇌전증 환자의 유전적 특성이 명확해지고 표적 치료가 정립되면 환자들의 치료 결과가 향상될 것이다.