Involvement of endocan in vascular dysfunction in angiotensin Ⅱ-induced hypertensive mice

Abstract

Hypertension is a major risk factor for cardiovascular disease and is associated with high mortality rates worldwide. Endothelial dysfunction is crucial in the development and progression of hypertension and contributes to cardiovascular events. Endocan (endothelial cell-specific molecule-1, esm-1) is a soluble proteoglycan mainly released by endothelial cells. Recent studies have indicated elevated blood levels of endocan in hypertensive patients, proposing its potential as a biomarker for identifying endothelial dysfunction associated with hypertension. Despite growing interest in endocan's role in cardiovascular pathology, its precise function in hypertension remains unclear due to insufficient research data. The aim of this study is to investigate the role of endocan in blood pressure elevation and vascular endothelial dysfunction associated with hypertension and to explore the underlying mechanisms. Eight-week-old male C57BL/6 mice were treated with vehicle (saline) or endocan (0.6 mg/kg by intraperitoneal injection, every two days) or angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ, 1000 ng/kg/min) via osmotic minipumps for 4 weeks. Angiotensin Ⅱ-induced hypertensive mice were treated with either control immunoglobulin G (IgG) antibody (9 μg/mouse) or neutralizing endocan antibody (9 μg/mouse) twice a week. Systolic blood pressure was measured using tail-cuff system. After the mice were sacrificed, the serum endocan levels were assessed in all groups using a mouse endocan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit. Vascular function was evaluated in mesenteric resistance arteries using a multi-wire myograph system. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were treated with various concentrations of Ang Ⅱ (0, 0.01, 0.1, 1, 10 μM) or endocan (0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 μM) or tumor necrosis factor-α (TNF-α, 0, 0.1, 1, 10, 100 ng/mL) or combination of endocan and TNF-α inhibitor etanercept (0.1, 1, 10, 100 μg /mL) for 24 hours. The phosphorylated endothelial nitric oxide synthase (eNOS, Ser1177) was measured by western blot analysis. Nitrite levels were quantified in the cell culture medium using the Griess reagent kit. Administration of endocan significantly increased systolic blood pressure. Endothelium-dependent relaxation was significantly reduced in the mesenteric resistance arteries of endocan-treated mice compared to vehicle (saline)-treated mice. However, there was no difference in vascular relaxation induced by sodium nitroprusside dehydrate or in contraction induced by U46619 between the two groups. Furthermore, endothelium-dependent relaxation was markedly reduced in Ang Ⅱ-induced hypertensive mice, which was associated with an increase in serum endocan levels. Interestingly, administration of neutralizing endocan antibodies to Ang Ⅱ-induced hypertensive mice decreased blood pressure. Endothelium-dependent relaxation was significantly improved in the mesenteric resistance arteries of neutralizing endocan antibody-treated hypertensive mice compared to control IgG antibody-treated hypertensive mice. Treatment of Ang Ⅱ on HUVECs induced a concentration-dependent elevation of endocan levels in both cell culture medium and cell lysates. Administration of Ang Ⅱ and endocan induced a concentration-dependent reduction in phosphorylated eNOS and nitrite levels in HUVECs. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) levels were elevated in both endocan-treated mice and Ang Ⅱ-induced hypertensive mice. Administration of TNF-α reduced phosphorylated eNOS and nitrite levels in HUVECs. Inhibition of TNF-α with etanercept reversed the endocan-induced decreases in eNOS phosphorylation and nitrite levels in HUVECs. Our findings suggest that endocan contributes to endothelial dysfunction and blood pressure elevation in Ang Ⅱ-induced hypertensive mice, potentially through TNF-α-mediated suppression of eNOS activity. 고혈압은 심혈관 질환의 주요 위험 요인으로 전 세계적으로 높은 사망률과 관련이 있다. 내피 세포 기능 장애는 고혈압의 발병과 진행에 중요한 역할을 하며 따라서 심혈관 질환의 원인이 된다. 최근 임상 연구에서는 내피 세포에서 분비되는 수용성 더마탄 설페이트 프로테오글리칸(soluble dermatan sulfate proteoglycan)인 엔도칸(endocan, 내피세포 특이 분자-1)이 정상 혈압을 가진 사람보다 고혈압 환자의 혈액에서 증가한 것으로 보고되었으며 고혈압 환자의 내피세포 기능 장애(endothelial dysfunction)를 감지하는 바이오 마커로 제안되고 있다. 엔도칸은 주로 내피 세포에서 분비되고 혈액을 통해 순환한다고 알려져 있다. 고혈압과 엔도칸의 연관성에 대한 연구는 충분하지 않으며 그 관련 기전에 대해서도 명확하게 밝혀지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 고혈압에서 나타나는 혈압 상승 및 혈관 내피 기능 장애에서 엔도칸의 역할을 규명하고 관련 기전을 조사하고자 한다. 본 실험에서는 엔도칸의 증가가 혈압의 변화와 혈관 기능에 영향을 주는지 조사하였다. 마우스에 엔도칸(0.6 mg/kg) 또는 생리식염수(200 ul)를 약 4주 동안 2일에 1번씩 복강 내 주사하였다. 식염수를 투여한 마우스의 혈압에 비해 엔도칸을 투여한 마우스의 혈압이 유의하게 증가됨을 확인하였다. 엔도칸 투여로 인한 혈압 상승이 혈관 기능 이상으로 인하여 나타나는지 알아보고자 멀티-와이어 마이오 그래프 시스템(multi-wire myograph system) 장비를 사용하여 마우스 장간막 저항 동맥(mesenteric resistance arteries)에서 혈관 기능을 측정하였다. 식염수를 투여한 그룹보다 엔도칸을 투여한 그룹에서 내피세포 의존성 혈관 이완(endothelium-dependent relaxation) 반응이 유의하게 감소된 것으로 나타났으며 나이트로프루사이드 나트륨(sodium nitroprusside, SNP)에 의한 내피 세포 비의존성 혈관 이완(endothelium-independent relaxation) 반응과 트롬복산 A2 수용체 작용제(thromboxane A2 receptor agonist, U46619)로 유도된 혈관 수축 반응에는 엔도칸 투여가 영향을 주지 않음을 확인하였다. 안지오텐신 Ⅱ(angiotensin Ⅱ, 1000 ng/kg/min) 또는 식염수(0.25 μl/hour)는 오스모틱 미니 펌프(osmotic minipump)를 통해 약 4주 마우스에 투여하였으며 엔도칸 중화 항체(neutralizing endocan antibody, 9 μg/mouse) 또는 IgG(9 μg/mouse)는 일주일에 2번 복강주사를 통해 투여하였다. 안지오텐신 Ⅱ로 유발된 고혈압 마우스에서는 혈압이 유의하게 증가되어 있었고 내피세포 의존성 혈관 이완 반응이 감소되어 있었는데 이는 엔도칸 중화 항체 투여로 인하여 개선되었다. 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cells)에 안지오텐신 Ⅱ(0, 0.01, 0.1, 1, 10 μM)를 처리하면 세포 배양 배지와 용해된 세포의 상층액에서 농도 의존적으로 엔도칸이 증가함을 확인하였다. 내피 세포에 안지오텐신 Ⅱ와 엔도칸(0, 0.001, 0.1, 1, 10 μM)을 처리하면 내피 산화 질소 합성 효소(endothelial nitric oxide synthase)의 인산화가 감소되었으며 산화 질소(nitric oxide)의 산화과정에서 생기는 아질산(nitrite)도 감소됨을 확인하였다. 엔도칸을 투여한 마우스와 안지오텐신 Ⅱ로 유발한 고혈압 마우스의 혈액에서 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 종양괴사인자 알파(tumor necrosis factor-α, TNF-α)의 농도가 증가함을 확인하였고 TNF-α(0, 0.1, 1, 10, 100 ng/mL)를 내피 세포에 처리하면 내피 산화 질소 합성 효소의 인산화와 아질산의 농도가 유의하게 감소됨을 확인하였다. 내피 세포에 1 μM 엔도칸 처리로 감소된 내피 산화 질소 합성 효소의 인산화와 아질산의 농도가 TNF-α억제제인 에타너셉트 (etanercept, 0.1, 1, 10, 100 μg/mL) 처리에 의해 증가함을 확인하였다. 본 연구에서는 엔도칸이 TNF-α를 매개로 하여 내피 산화 질소 합성 효소의 인산화를 억제시켜 고혈압에서 나타나는 내피 기능 장애와 혈압 상승에 영향을 준다는 것을 규명하였다. 그리고 엔도칸 중화항체를 통해 엔도칸을 억제하면 안지오텐신 Ⅱ로 유발된 혈관 기능 이상과 혈압 상승이 완화된다는 것을 밝혔다. 따라서 본 연구의 결과는 엔도칸이 고혈압을 치료하는데 새로운 치료 표적이 될 수 있음을 제시한다.