The effect of YAP inhibition on radiation resistance in head and neck cancer

Abstract

목적: 두경부암의 치료는 수술, 방사선치료, 항암화학요법을 포함하는 다학제적인 접근을 필요로 한다. 그러나 이러한 다학제적인 치료에도 불구하고 국소 재발율이 여전히 높아 효과적인 구제적 치료가 필요한 실정이다. 재발한 종양은 종종 항암화학요법이나 방사선치료에 저항성을 보이기에 임상적 접근이 어렵다. Hippo 신호전달경로는 여러 암종에서 주요한 종양 억제 체계로 알려져 있으며, 그 하위 시그널 분자인 Yes-associated protein (YAP)은 세포 증식, 세포 생존 및 치료 저항성 등 다양한 과정에 관여하는 것으로 여겨진다. 이전 연구들에서 YAP이 두경부암에서 종종 증폭되어 있으며, YAP이 과발현된 경우 두경부암의 예후가 좋지 않음을 밝혀낸 바 있다. 본 연구는 두경부암 세포주에서 YAP이 방사선 저항성에 미치는 역할을 평가하고자 하였다. 대상 및 방법: 두경부암 세포주를 스크리닝하여 상대적으로 YAP 발현 정도가 높고 방사선 저항성을 띄는 HEP-2 세포주를 선택하였다. YAP을 타겟으로 한 short hairpin RNA (shRNA) 및 small interfering RNA (siRNA)를 사용하여 YAP을 억제한 후 세포 특성의 변화를 살펴보았다. YAP의 약리학적 억제를 위해서는 Verteporfin 및 CA3를 사용하였다. Nude mouse 모델에서 YAP이 억제된 세포의 생체내 (in vivo) 종양 형성 능력을 평가하였으며, 세포 증식, 집락 형성 및 세포 사멸 분석을 통해서는 YAP의 억제와 방사선 조사의 병용 투여가 시너지 효과를 나타내는지를 확인하였다. 또한, YAP 억제 및 방사선 조사 후 Cyclin D1 과 γH2AX foci의 발현 변화를 확인하였다. 결과: YAP의 억제는 세포 증식의 감소, 세포 이동성의 감소, 방사선 감수성 증가 및 세포 사멸 촉진을 초래하였다. 또한, YAP 억제 시 in vivo에서의 종양 형성 또한 유의하게 감소함을 확인하였다. YAP 억제와 방사선 조사의 병용 투여는 세포 증식 및 세포 사멸 측면에서 YAP 억제 또는 방사선 조사 단독 보다 시너지 효과를 나타내었다. 또한, YAP의 억제는 G0/G1 세포 주기 정지를 유도하였다. 더 나아가 YAP의 발현 정도는 Cyclin D1의 발현과 상관관계를 보였으며, YAP의 억제와 방사선치료의 병용 투여는 Cyclin D1 발현 정도의 감소를 유발하였고, 이는 DNA 손상의 증가로 이어졌다. 결론: YAP은 두경부암 세포에서 세포 증식, 이동 및 세포 사멸에 관여하며, YAP 억제 시 방사선 감수성이 향상되었다. 또한 YAP은 Cyclin D1의 조절을 통해 방사선 조사 후 DNA 손상 반응에 관여하는 것으로 생각된다. YAP을 표적으로 하는 치료는 두경부암에서 방사선 저항성을 극복할 수 있는 잠재적인 치료 전략이 될 것이다. Purpose: The treatment of head and neck cancer requires a multidisciplinary approach involving surgery, radiotherapy, and chemotherapy. However, despite these multimodal treatments, the local recurrence rate remains high, and effective salvage therapies are urgently needed. Recurrent tumors are often resistant to chemotherapy or radiotherapy, presenting a significant clinical challenge. The Hippo pathway is a major tumor suppressor pathway in many cancers, and its downstream effector molecule Yes-associated protein (YAP) is thought to play a role in various processes, including cell proliferation, cell survival, and treatment resistance. YAP is frequently amplified in head and neck cancer, and previous studies have identified its amplification as a poor prognostic factor for head and neck cancer. This study aims to assess the role of YAP in radiation resistance in head and neck cancer cell lines. Materials and Methods: After screening 20 head and neck cancer cell lines, we identified HEP-2 as a cell line with relatively high YAP expression and radioresistance. Using short hairpin RNA (shRNA) and small interfering RNA (siRNA) targeting YAP, we investigated the changes in cellular characteristics following YAP knockdown. For pharmacological inhibition of YAP, we used Verteporfin and CA3. In vivo tumorigenicity of YAP knockdown cells was assessed in nude mice. Cell proliferation, clonogenic, and apoptosis assays were performed to assess whether combining YAP inhibition with irradiation induced any synergistic effects. The change in the expression level of Cyclin D1 and γH2AX foci were investigated upon YAP inhibition and irradiation. Results: YAP knockdown led to reduced cellular proliferation, diminished migration, enhanced radiosensitivity, and increased apoptosis compared with control cells. In vivo tumorigenicity results also confirmed that inhibition of YAP resulted in significantly decreased tumor volume. The combination of YAP knockdown and irradiation resulted in a synergistic effect compared to YAP knockdown or irradiation alone in terms of cell proliferation and apoptosis. In addition, YAP knockdown resulted in G0/G1 cell cycle arrest. Furthermore, YAP expression level was found to correlate with Cyclin D1 expression, and treatment with both pharmacologic YAP inhibition and irradiation resulted in decreased Cyclin D1 levels, which subsequently led to increased DNA damage. Conclusion: YAP is associated with cell proliferation, migration, and apoptosis in head and neck cancer cells. Additionally, YAP, through its regulation of Cyclin D1, is involved in cellular DNA damage response following irradiation. Targeting YAP may provide a potential strategy to overcome radioresistance in head and neck cancer.