Pendrin inhibition as a novel diuretic strategy: targeting diuretic resistance and angiotensin II-induced hypertension

Abstract

Background : Pendrin (SLC26A4) is an anion exchanger that plays a role in sodium chloride and water reabsorption in the kidney. It is localized to the apical membrane of β-intercalated and non-A/non-B intercalated cells in the connecting tubule and cortical collecting duct. Pendrin primarily mediates chloride reabsorption and bicarbonate secretion via Cl⁻/HCO3⁻ exchange and indirectly influences sodium reabsorption by modulating the epithelial sodium channel (ENaC) and the Na⁺-dependent Cl⁻/HCO3⁻ exchanger (NDCBE). Recent studies have demonstrated an interaction between pendrin and the Na-K-Cl cotransporter (NKCC2), showing that simultaneous inhibition of both transporters results in a potent diuretic effect in experimental models. This study aims to investigate the effects of a novel pendrin inhibitor on diuretic resistance, particularly under conditions of pendrin upregulation. To further evaluate the role of angiotensin II in this process, An angiotensin II-induced hypertension model is employed to investigate the pathophysiological context, and the synergistic diuretic effects of furosemide in combination with pendrin inhibitors are evaluated as a potential therapeutic strategy. Method : In vitro Cl⁻/HCO₃⁻ exchange activity was measured in pendrin-overexpressing PANC-1 cells using a pH-sensitive fluorescent dye following treatment with A4009. diuretic efficacy was tested in wild-type mice, a furosemide-resistant model, and an angiotensin II-induced hypertensive model. Urine output and electrolyte excretion were measured to assess the effects of A4009 alone and in combination with furosemide. In the angiotensin II-induced model, blood pressure was also measured. To elucidate the molecular mechanisms underlying pendrin pathway activation, the mRNA and protein expression levels of key sodium transporters and regulatory molecules were quantitatively evaluated in each animal model using real-time quantitative PCR (qPCR) and western blot analysis. Furthermore, Proximity Ligation Assay (PLA) and mRNA sequencing were conducted to elucidate the molecular interactions between pendrin and its associated signaling proteins. Result : A novel pendrin inhibitor, A4009, was identified through in vitro screening and evaluated for its inhibitory effects on pendrin-mediated Cl⁻/I⁻ and Cl⁻/ HCO3⁻ exchange, yielding IC₅₀ values of 59.5 ± 12.8 nM and 52.6 ± 15.7 nM, respectively. In wild-type mice, the co-administration of furosemide and A4009 led to a significant dose-dependent increase in urine output. This increase was accompanied by a significant rise in sodium (Na⁺) and chloride (Cl⁻) excretion compared to furosemide alone. While A4009 monotherapy had no effect on potassium (K⁺) excretion, co-administration with furosemide resulted in a significant increase. Additionally, urinary osmolality was significantly reduced in the combination groups, indicating enhanced urine dilution capacity. In the furosemide-resistant model, A4009 monotherapy modestly increased urine output, and co-administration with furosemide significantly increased urine output. Co-administration further increased Na⁺, Cl⁻, and K⁺ excretion and significantly decreased urine osmolality. This effect was associated with increased pendrin, Rac1, and NR3C2 expression, suggesting a functional link between pendrin activity and Rac1 signaling in diuretic resistance. The diuretic efficacy of A4009 was further confirmed in the angiotensin II-induced hypertension model. A4009 monotherapy did not significantly affect urine volume or electrolyte excretion, but co-administration with furosemide significantly increased urine output and electrolyte excretion, while reducing urine osmolality. A4009 alone effectively reduced blood pressure in hypertensive mice. This suggests that pendrin inhibition enhances the diuretic response and contributes to blood pressure reduction in hypertensive conditions. Conclusion : These findings suggest that pendrin inhibition may be effective in mitigating sodium and water retention under conditions of angiotensin II-induced hypertension and diuretic resistance. Our results highlight the potential of pendrin inhibitors as novel diuretic candidates, particularly in conditions where pendrin expression is upregulated. Future studies should further assess the long-term safety and efficacy of A4009 in pendrin-overexpressing models and explore its therapeutic applications in diverse pathophysiological conditions to expand its clinical relevance. 배경: Pendrin(SLC26A4)은 신장에서 염화나트륨(NaCl)과 수분 재흡수에 중요한 역할을 하는 음이온 교환체입니다. 이는 집합관의 연결 세뇨관(connecting tubule)과 피질 집합관(cortical collecting duct)의 β-세포와 non-A/non-B 세포의 세포 꼭대기막(apical membrane)에 위치하고 있습니다. Pendrin은 주로 염화이온(Cl⁻) 재흡수와 중탄산염(HCO3⁻) 분비를 Cl⁻/HCO3⁻ 교환을 통해 조절하며, 상피 나트륨 채널(ENaC) 및 Na⁺-driven Cl⁻/ HCO3⁻ 교환체(NDCBE)를 간접적으로 조절하여 나트륨 재흡수에도 영향을 미칩니다. 최근 연구에서는 pendrin과 Na-K-Cl 공동수송체(NKCC2) 간의 상호작용이 밝혀졌으며, 이 두 수송체를 동시에 억제하면 강력한 이뇨 효과가 나타나는 것으로 보고되었습니다. 본 연구는 pendrin 발현이 증가된 조건에서 신규 pendrin 억제제가 이뇨제 저항성에 미치는 영향을 평가하고자 하였습니다. 또한, Angiotensin II 유도 모델을 이용하여 Angiotensin II의 역할을 분석하고, furosemide와 pendrin 억제제의 병용 이뇨 효과를 평가하여 치료적 전략 가능성을 탐색하고자 하였습니다. 방법: A4009를 처리 후, pendrin을 과발현시킨 PANC-1 세포에서 pH-sensitive fluorescent dye을 이용하여 in vitro Cl⁻/HCO₃⁻ 교환 활성을 측정하였다. 이뇨 효과는 정상 생쥐, furosemide 저항성 모델, Angiotensin II 유도 고혈압 모델에서 평가되었고, A4009 단독 및 furosemide 병용 투여 후 소변량과 전해질 배설량을 측정하였습니다. Angiotensin II 모델에서는 혈압도 함께 측정하였습니다. 또한 각 동물 모델에서 pendrin 경로 활성화의 분자적 기전을 규명하기 위해 나트륨 수송체 및 조절 인자의 mRNA 및 단백질 발현을 정량적 실시간 PCR(qPCR)과 Western blot 분석을 통해 정량 평가하였습니다. 또한, pendrin과 신호전달 관련 단백질 간의 상호작용을 확인하기 위해 Proximity Ligation Assay (PLA)과 mRNA sequencing을 수행하였다. 결과: 신규 pendrin 억제제인 A4009는 in vitro 스크리닝을 통해 발굴되었으며, Cl⁻/I⁻ 및 Cl⁻/ HCO3⁻ 교환에 대한 억제 효과는 각각 IC₅₀ 59.5 ± 12.8 nM 및 52.6 ± 15.7 nM으로 나타났습니다. 정상 생쥐에서는 furosemide와 A4009 병용 시 용량 의존적으로 소변량이 유의미하게 증가하였고, Na⁺, Cl⁻, K⁺ 배설이 증가하며, 소변 삼투압이 유의미하게 감소하였습니다. Furosemide 저항성 모델에서는 A4009 단독 투여가 소변량을 다소 증가시켰고, 병용 투여는 소변량과 Na⁺, Cl⁻, K⁺ 배설을 증가시키고, 소변 삼투압을 유의미하게 감소시켰습니다. 이는 Angiotensin II에 의해 유도된 Rac1의 활성화가 MR의 전사 조절 및 pendrin 유전자 발현 증가에 관여함을 시사하며, Rac1–MR–pendrin 경로의 작동 가능성을 뒷받침한다. Angiotensin II 유도 고혈압 모델에서 A4009의 이뇨 효과가 확인되었습니다. A4009 단독 투여는 소변량과 Na⁺, K⁺, Cl⁻ 배설에 유의미한 영향을 미치지 않았으나, furosemide와 병용 투여 시 소변량과 전해질 배설이 유의미하게 증가하고, 소변 삼투압은 감소하였습니다. A4009는 단독으로도 고혈압 생쥐의 혈압을 감소시켰으며, pendrin 억제가 이뇨 반응을 증강시키고 고혈압 상태에서 혈압을 낮추는 데 기여할 수 있음을 시사합니다. 결론: 본 연구는 pendrin 억제가 Angiotensin II 유도 고혈압 및 이뇨제 저항성 조건에서 나트륨 및 수분 저류를 완화하는 데 효과적일 수 있음을 제시합니다. pendrin 발현이 증가된 조건에서 pendrin 억제제가 새로운 이뇨제 후보로서의 가능성을 강조합니다. 향후 연구는 pendrin 과발현 모델에서 A4009의 장기적인 안전성, 효능, 그리고 임상적 적용 가능성을 추가적으로 평가하고, 다양한 병리적 조건에서의 치료적 응용 가능성을 탐색해야 합니다.