Systematic screening and analysis of disease-relevant mutations using prime editors

Abstract

Manipulating DNA materials through recombinant DNA technologies has been the foundation of modern biological and medical research. Each innovative breakthrough through re-engineered techniques from nature has opened new frontiers for understanding complex genetic mechanisms and created new opportunities for tackling genetic diseases. First discovered in bacteria as a form of adaptive immunity against viral genetic materials, elucidation of the CRISPR-Cas9 system has allowed for its wide application in nearly all fields of biology and medicine, such as the analysis of large-scale screenings for therapeutic targets of various drugs in the treatment of cancers and hereditary diseases1. Since then, concerted efforts by laboratories across the world have aided in the advancement of its application potential, specificity, and programmability for genome editing, leading to the development various Cas9 variants and base editors2-4. Most recently, Dr. Liu’s group introduced prime editing, a bio-engineered form of the CRISPR-Cas9 system that intrinsically alleviated many of the limitations of the canonical system by combining a reverse transcriptase to the Cas9 protein. Notably, prime editing has significantly improved genome editing by allowing for the introduction of potentially any combination of specific genetic alterations without requiring donor DNAs or double-strand breaks5. However, determining the optimal conditions for improving prime editing efficiencies in various experimental factors required extensive time and resources. Our previous effort evaluated the efficacies of around 50K pairs of prime editing guide RNAs (pegRNAs) and their target sequences in human cells. In doing so, we determined features that affect prime editing efficiency and constructed three computational models that can predict pegRNA efficiencies. Although our efforts provided valuable insights for practical applications of prime editing in future studies, our approach was limited to a set of specific alteration types and positions. In this study, we aim to expand our data a degree of magnitude to 600K pairs of pegRNAs and their efficiencies in inducing any combination of alterations up to 3 nucleotides in size. In doing so, we aim to identify and evaluate the impact of factors that contribute to prime editing efficiency. In addition, we will carefully curate our pegRNA and target pairs using the extensive repertoire of disease relevant mutations available on the ClinVar database so that their prime editing efficiencies could be better evaluated within the context of disease therapy and modeling. We also aim to evaluate the optimal prime editing conditions in various cell lines and compare other variants of prime editors that have been recently reported5. Taken together, we found that our vastly expanded pegRNA design can cover up to 87% of reported disease-relevant mutations. Using our large-scale profiling data, we will develop a significantly improved prediction model based on the latest deep learning-based algorithms. Our work is expected to provide a more comprehensive tool to aid future works in expanding the application of prime editing in basic and clinical research efforts.

재조합 DNA 기술을 통한 DNA 물질 조작은 현재 생물학 및 의학 연구의 기초가 되었다. 자연에서 재설계되거나 재구성된 기술을 통한 각각의 혁신적인 이노베이션은 복잡한 유전 메커니즘을 이해하기 위한 새로운 지평을 열었고 유전 질환을 해결할 수 있는 새로운 기회를 창출했다. 바이러스 유전 물질에 대한 적응 면역의 한 형태로 박테리아에서 처음 발견된 CRISPR-Cas9 시스템의 연구는 다양한 치료 표적에 대한 대규모 스크리닝 분석과 대다수의 생물학 및 의학 분야에 적용할 수 있게 되었다. 그 이후로 전 세계 실험실의 여러 노력으로 게놈 편집에 대한 응용 가능성, 특이성 및 프로그래밍 가능성이 향상되어 다양한 Cas9 변이체 및 기본 편집기가 개발되었다. 가장 최근에 Liu 의 그룹은 역전사효소를 Cas9 단백질에 결합하여 표준 시스템의 많은 한계를 본질적으로 개선하는 CRISPRCas9 시스템의 생체 공학 형태인 프라임에디팅을 도입했다. 특히, 프라임에디팅은 기증자 DNA 또는 이중 가닥 절단 없이 특정 유전자 변형의 잠재적인 조합을 도입할 수 있게 함으로써 게놈 편집을 크게 개선했다. 그러나 다양한 실험적 요인에서 프라임에디팅 효율을 향상시키기 위한 최적의 조건을 결정하는 데는 많은 시간과 자원이 필요하다. 이전 노력은 인간 세포에서 약 50K 쌍의 프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA)와 표적 서열의 효능을 평가했다. 이를 통해 프라임에디팅 효율성에 영향을 미치는 기능을 결정하고 pegRNA 효율성을 예측할 수 있는 세 가지 계산 모델을 구성했다. 우리의 노력이 미래 연구에서 프라임에디팅의 실제 적용을 위한 귀중한 통찰력을 제공했지만, 우리의 접근 방식은 일련의 특정 변경 유형 및 위치로 제한되었다. 본 연구에서는 데이터를 600K 쌍의 pegRNA로 크게 확장하고 최대 3 개의 염기서열 크기까지 변경 조합을 유도하는 효율성을 목표로 합니다. 이를 통해 주요 편집 효율성에 기여하는 요소의 영향을 식별하고 평가하는 것을 목표로 한다. 또한, 우리는 linVar 데이터베이스에서 사용할 수 있는 광범위한 질병 관련 돌연변이 레퍼토리를 사용하여 pegRNA 및 표적 쌍을 신중하게 선별하여 질병 치료 및 모델링의 맥락에서 주요 편집 효율성을 더 잘 평가할 수 있게 도입예정이다. 우리는 또한 다양한 세포줄기에서 최적의 프라임에디팅 조건을 평가하고 최근에 보고된 프라임에디팅의 다른 변이체를 비교하는 것을 목표로 한다. 종합하면, 우리는 광범위하게 확장된 pegRNA 디자인이 보고된 질병 관련 돌연변이의 최대 88%를 포함할 수 있음을 확인했다. 우리의 대규모 프로파일링 데이터를 사용하여 최신 딥러닝 기반 알고리즘을 기반으로 크게 개선된 예측 모델을 개발했다. 우리의 노력은 기본 및 임상 연구 노력에서 프라임에디팅의 적용을 확장하는 미래 작업에 크게 도움이 되고 포괄적인 도구를 제공할 것으로 기대한다.