Protein kinase C and matrix metalloproteinases expression using PMA in degenerative intervertebral disc cells

Abstract

Background: There are many factors involved in the senescence of these NP cells, and the relationship between the canonical Wnt/b-catenin signaling pathway and matrix metalloproteinases (MMPs) is known to be important in senescence. A study using rats suggested the possibility that protein kinase C (PKC), an intermediate product of the non-canonical Wnt pathway stimulated by phorbol myristate acetate (PMA), prevents senescence of NP cells. The purpose of this study is to study the non-canonical, canonical Wnt pathway and MMPs expression after stimulating human NP cells with PMA to find out whether NP cell senescence can be prevented degenerative spinal diseases. Methods: Human disc tissues were collected during surgery from patients and cultured. The NP cells were seeded at a cell density of 70 cells cm-1 for protein and RNA isolation in condition treated with PMA (400μM) for 24 hours. Western blot was performed to detect expressions of MMP1, MMP13, TIMP1, ADAMTS5, TRPV4, interluekin6 and β-catenin and RT-PCR was used to confirm type II collagen, glycosaminoglycan (GAG) at the mRNA. Also, ELISA was accomplished to interleukin6 and prostaglandin E2. Results: The protein expression of PKC delta (Intermediates of the non-canonical Wnt pathway) and β-catenin (Intermediates of the canonical Wnt pathway) was slightly increased with PMA compared to control. The phosphorylation of β-catenin is increased with PMA. The mRNA level of type II collagen and GAG, which play an important role in NP cell senescence, increased slightly, but there was no actual increase in protein. Rather, there were many changes in various other MMPs. MMP1, MMP13, TIMP1, TRPV4, interleukin6 PGE2 and ADAMTS5 expression at the protein were also increased in condition treated with PMA. Conclusions: PMA increased PKC in the non-canonical Wnt pathway, but its effect on beta catenin in the canonical Wnt pathway was minimal and did not increase GAG and type II collagen. On the other hand, PMA increases other inflammation factors and MMPs, and this effect is thought to be greater than its effect on the Wnt pathway. Therefore, it is difficult to prevent senescence and degradation through non-canonical Wnt activation using PMA in human NP cells.

배경: NP 세포의 노화에는 많은 요인이 관여하며 표준 Wnt/β- catenin 신호전달경로와 기질 금속단백분해효소(MMP) 사이의 관계는 노화에 중요한 것으로 알려져있습니다. 쥐를 이용한 연구에서 phorbol myristate cetate (PMA)에 의해 자극된 non-canonical Wnt pathway의 중간 산물인 protein kinase C (PKC)가 NP 세포의 노화를 예방할수 있는 가능성을 제시했습니다. 본 연구의 목적은 PMA로 인간 NP 세포를 자극한 후 비표준적, 표준적 Wnt 경로 및 MMP 발현을 연구하여 NP 세포의 노화가 퇴행성 척추 질환을 예방할수 있는지 여부를 알아내는것입니다. 방법: 수술중의 환자로부터 인간 디스크 조직을 수집하여 배양하였고 NP 세포를 24시간 동안 PMA(400μM)로 처리한 조건에서 단백질 및 RNA 분리를 위해 70 세포 cm-1의 세포밀도로 파종하였습니다. MMP1, MMP13, TIMP1, ADAMTS5, TRPV4, IL6 및 β- catenin의 발현을 검출하기 위해 Western blot을 수행하였고 mRNA에서 II형 콜라겐, 글리코사미노글리칸(GAG)을 확인하기 위해 RT-PCR을 사용하였습니다. 또한, ELISA는 IL6 및 PGE2에 달성되었습니다. 결과: PKCδ (비표준 Wnt 경로의 중간체)와 β- catenin(표준 Wnt 경로의 중간체)의 단백질 발현은 대조군에 비해 PMA에서 약간 증가했습니다. β- catenin의 인산화도 PMA와 함께 증가하였니다. NP 세포 노화에 중요한 역할을 하는 II형 콜라겐과 GAG의 mRNA 수치는 약간 증가했지만 실제 단백질 증가는 없었습니다. 오히려, 다양한 다른 MMP에서 많은 변화가 있었습니다. MMP1, MMP13, TIMP1, TRPV4, IL6, PGE2 및 단백질에서의 ADAMTS5 발현도 PMA로 처리된 조건에서 증가했습니다. 결론: PMA는 비표준 Wnt 경로에서 PKC를 증가시켰지만 표준 Wnt 경로에서 βcatenin에 대한 효과는 미미했으며 GAG 및 II형 콜라겐을 증가시키지 않았습니다. 한편, PMA는 다른 염증 인자인 MMP를 증가시키며 이 효과는 Wnt 경로에 미치는 영향보다 더 큰 것으로 생각됩니다. 따라서 인간 NP 세포에서 PMA를 이용한 비표준 Wnt 활성화를 통한 노화 및 퇴화를 예방하는 것은 어렵습니다.