Evaluating the Efficacy and Minimum Effective Dosage of Mesenchymal Stem Cell Therapy in a Murine Model of Critical Limb Ischemia

Abstract

Purpose: This study aimed to investigate the therapeutic potential of embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells (E-MSCs) in mitigating tissue damage and promoting angiogenesis under ischemic conditions, such as critical limb-threatening ischemia. Additionally, we aimed to determine the optimal dose required to achieve effective treatment outcomes. Material and Methods: A hindlimb ischemia model was established using 85 BALB/c nude mice (7-week-old, female). The mice were divided into five groups of 17 mice each: non-ischemia (Group 1, sham), saline-treated ischemia (Group 2, control), and E-MSC-treated ischemia using low, medium, and high doses of treatment (Groups 3–5). The efficacy and minimum effective dosage were evaluated using the rotarod test, necrosis assays, blood perfusion ratio; and histological, inflammatory, and angiogenic cytokine analyses. Results: Laser Doppler perfusion imaging showed significant recovery in blood perfusion ratios in E-MSC-treated groups compared to controls, with the medium-dose group showing the most notable improvement. In the E-MSC-treated groups, motor function improved over time; however, no significant difference was noted in the necrosis score among groups. The expression of inflammatory cytokines (tumor necrosis factor-α, interleukin (IL)-1β, IL-6, and transforming growth factor-β) and angiogenic cytokines (angiopoietin-1, fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, and platelet-derived growth factor) increased in the ischemia-induced groups. In the E-MSC-treated groups, initial inflammatory cytokine expression decreased, whereas angiogenic cytokine expression increased compared to Group 2. However, no significant differences were found based on the dose of E-MSCs. Ischemia-induced groups showed decreased myofiber thickness and number, increased inflammatory cells, and collagen fibers compared to sham. Over time, E-MSC-treated groups showed similar myofiber thickness but increased myofiber number and decreased inflammatory cells and collagen fibers compared to controls, with no dose-dependent differences. Conclusion: While E-MSCs enhanced blood perfusion and regulated cytokines in the ischemic hindlimb model, dose-related differences were not significant. These cells exhibit crucial pro-angiogenic and immunomodulatory effects necessary for tissue repair. However, further research is needed to determine the optimal dose that maximizes their efficacy and to gain a precise understanding of the mechanisms for clinical application.

목적: 본 연구는 배아 줄기 세포로부터 유래한 중간엽 줄기세포 (E-MSCs)가 심각한 사지 위협 허혈 (CLTI)과 같은 허혈성 상태에서 조직 손상 완화 및 혈관신생 촉진의 치료 잠재력을 조사하는 것이다. 또한, 효과적인 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 최적 용량을 결정하고자 하였다. 재료 및 방법: 85마리의 BALB/c 누드 마우스 (7주령, 암컷)를 사용하여 하지 허혈 모델을 확립하였다. 마우스는 각각 17마리씩 다섯 그룹으로 나누었다: 비허혈 (그룹 1, 무처리군), 생리식염수 처리 허혈 (그룹 2, 대조군), 저용량, 중간 용량, 고용량의 E-MSC 처리 허혈 (그룹 3–5). 효능과 최소 유효 용량은 회전막대 실험, 괴사 측정, 혈액 관류 비율 (혈류율), 조직학적 및 염증 및 혈관신생 사이토카인 분석을 통해 평가되었다. 결과: 레이저 도플러 관류 검사는 E-MSC 처리 그룹에서 혈류율이 대조군에 비해 유의하게 회복되었으며, 중간 용량의 E-MSC 처리 그룹이 가장 뚜렷한 개선을 보였다. E-MSC 처리 그룹에서는 시간이 지남에 따라 운동 기능이 향상되었지만, 그룹간 괴사 점수에는 유의한 차이가 없었다. 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6 및 TGF-β) 및 혈관신생 사이토카인(ANG-1, FGF, VEGF 및 PDGF)의 발현은 허혈 유도 그룹에서 증가하였다. E-MSC 처리 그룹에서는 그룹 2와 비교하여 초기 염증성 사이토카인의 발현이 감소한 반면, 혈관신생 사이토카인의 발현은 증가하였다. 그러나 E-MSC 용량에 따른 유의한 차이는 발견되지 않았다. 허혈 유도 그룹은 비허혈 그룹에 비해 근섬유 두께 및 수가 감소하고, 침윤된 염증 세포 및 콜라겐 섬유가 증가하였다. 시간이 지남에 따라 E-MSC 처리 그룹은 대조군에 비해 유사한 근섬유 두께를 보였으나, 근섬유 수가 증가하고 침윤된 염증 세포 및 콜라겐 섬유가 감소하였으며, 용량 의존적인 차이는 없었다. 결론: E-MSC는 하지 허혈 모델에서 혈류율을 개선하고 염증 및 혈관신생 사이토카인을 조절하였으나, 용량에 따른 차이는 유의하지 않았다. 이러한 세포는 조직복구에 필수적인 혈관신생 및 면역조절 효과를 나타내지만, 이들의 효능을 극대화하기 위한 최적의 용량을 결정하고, 임상적용을 위한 메커니즘을 명확히 이해하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.