Discovery of novel EGFR VUS related to drug sensitivity using high-throughput prime editing screening

Abstract

Variants of uncertain significance (VUS) pose challenges in the clinical interpretation of genetic information across various diseases. Despite numerous efforts by researchers to decipher the implications of these mutations, the majority of single nucleotide substitution mutations remain classified as VUSs. Existing methodologies have attempted to elucidate variant effects using approaches such as cDNA expression, Cas9-based homology-directed repair, base editing, and prime editing. However, these methods encounter limitations stemming from non-physiological approaches, low editing efficiency, inadequate coverage, and imprecise assessments, respectively, thereby failing to conclusively specify variant effects. Here, we developed SynPrime, a novel method that incorporate an additional synonymous edit near the targeted SNV, demonstrating remarkably high accuracy in evaluating variant effects. Through the application of SynPrime, we functionally assessed 2,476 SNVs within the EGFR gene, encompassing 99% of all potential variants within the canonical tyrosine kinase domain (exons 18 to 21). Moreover, we determined the resistance profiles of 95% of all conceivable EGFR protein variants encoded in the entire tyrosine kinase domain (exons 18 to 24) against afatinib, osimertinib, and osimertinib in the presence of the co-occurring T790M mutation. Our study demonstrates the potential to significantly improve the precision of variant functional assessment and contributes to addressing the issue of VUS by being applied to other genes and diseases.

단일염기변이의 표현형을 이해하는 것은 종양과 더불어 다양한 질병에서 해결해야 할 과제로 남아있음. 하지만, 이러한 유전변이를 적절히 유발하고 평가하는 방법에 있어 기술적인 한계가 있는 상황임. 본 연구에서는 프라임 편집기를 이용하여 단일염기변이를 대량으로 유발하면서 그 표현형을 정확도 높게 평가할 수 있는 기술인 ‘신프라임’을 최초로 개발하였음. 이는 평가하고자 하는 단일염기변이 인접코돈에 동의 돌연변이 (Synonymous mutation)을 추가적으로 도입함으로써 프라임편집기 교정 효율을 높이고 시퀀싱 기법상에서의 에러와의 구분을 높은 정확도로 해주는 방법임. 본 연구에서는 해당 기술을 이용하여 표피성장인자수용체 (EGFR) 유전자의 티로신키나제 (Tyrosine kinase) 도메인에 대해 2,476개의 단일염기변이를 대량으로 유발하였고, 2세대 및 3세대 티로신키나제억제제에 대한 암변이의 저항성 여부를 평가함. 또한, T790M 변이를 동반한 단일염기변이를 대량으로 유발하여 암변이의 항암제 저항성을 평가함. 스크리닝 결과가 가이드라인 수준의 결과와 일치하며, 개별테스트와 동물실험에서도 재현되는 것을 확인함. 본 연구에서 제시한 스크리닝 방법은 단일 염기 수준의 세포변이의 기능변화를 높은 정확도로 평가함으로써 다양한 질병과 유전자에서 변이의 표현형을 평가하는 데에 활용할 수 있을 것으로 기대됨.