The therapeutic role of histone deacetylase (HDAC) inhibition in an in vitro model of Graves’ orbitopathy

Abstract

Graves’ orbitopathy (GO) manifested by Graves’ disease (GD) is characterized by orbital fibroblast-induced inflammation leading to fibrosis or adipogenesis. Histone deacetylases (HDACs) counteracting histone acetyltransferase activity play a central role in modifying autoimmune diseases and fibrosis. Moreover, HDAC inhibitors have been approved for use against hematologic malignancies. We investigated HDAC inhibition in orbital fibroblast from Graves’ orbitopathy in order to evaluate its potential as a therapeutic agent. HDACs gene expression levels in orbital tissues and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were screened. The effect of the HDAC inhibitor, Panobinostat, on orbital fibroblasts was examined. Primary cultured orbital fibroblasts from GO and normal subjects were treated with Panobinostat under the stimulation of IL-1β or TGF-β. Adipocyte differentiation was made in an adipogenic medium adding IL-1β. Inflammatory cytokines, fibrosis, and adipogenesis-related proteins were analyzed using western blotting. To evaluate the selectivity of Panobinostat, the effect of Panobinostat on the expression of HDACs mRNA was measured in GO orbital fibroblasts using real-time PCR and HDAC7 was knocked down using small interfering RNA (siRNA) transfection. Using Oil Red O, cells were stained to quantify lipid accumulation. Panobinostat reduced the production of IL-1β-induced inflammatory cytokines such as IL-6, IL-8, and TGF-β-induced fibrosis-related proteins such as collagen I⍺/3, ⍺-SMA, and fibronectin. In addition, Panobinostat suppressed adipocyte differentiation and production of C/EBP⍺/β, aP2, adiponectin, leptin, and PPARγ proteins. Panobinostat significantly attenuated HDAC7 mRNA expression in orbital fibroblasts from GO, and the silencing of HDAC7 also showed anti-inflammatory and anti-fibrotic effects. Panobinostat by inhibiting HDAC7 gene expression, suppressed the production of inflammatory cytokines, profibrotic proteins, and adipogenesis in GO orbital fibroblasts. Our in vitro study using primary cultured orbital fibroblasts suggests that HDAC7 can be a potential therapeutic target to inhibit inflammation, adipogenesis, and fibrotic mechanisms of GO. 갑상선안병증은 갑상선항진증 환자에서 나타나는 안와염증으로, 활성화된 안와섬유모세포에 의해 유발된 염증이 섬유화 또는 지방분화로 이어지는 것이 특징이다. Histone deacetylase (HDAC)은 histone acetyltransferase (HAT) 와 상반되는 역할을 하며 히스톤단백질 및 그 외의 단백질에 deacetylation을 하는 효소로, 자가면역질환이나 섬유증에 관여한다고 알려져 있다. 또한, HDAC 억제제는 최근 혈액암에 대한 사용이 승인되어 널리 사용되고 있다. 이에 따라 우리는 갑상선안병증에서 HDAC 억제제의 치료제로서의 잠재력을 평가하기 위해 일차배양한 안와섬유모세포에서 HDAC 억제에 의한 영향을 확인하였다. 먼저, 갑상선 안병증환자와 정상환자의 안와조직과 혈액에서 HDAC의 mRNA 발현수준을 확인하였고, 일차배양한 안와섬유모세포에서 HDAC 억제제인 Panobinostat의 영향을 확인하였다. 안와섬유모세포에서 IL-1β 혹은 TGF-β 자극하에 Panobinostat를 처리하여 발현되는 염증성 사이토카인(cytokine)이나 섬유증 및 지방형성에 관련한 단백질을 웨스턴블랏(western blot)을 이용하여 분석하였다. mRNA는 정량적 실시간 PCR을 통해 측정하였고, Oil red O 염색을 통해 세포내의 지질축적량을 정량화 하였다. Panobinostat의 세포특이적인 HDAC 억제효과를 평가하기 위해 갑상선안병증환자에서 채취하여 일차배양된 안와섬유모세포에서 Panobinostat에 의한 HDAC mRNA 발현억제정도를 다양한 HDAC에서 확인하였고, small interfering RNA (siRNA)를 세포에 transfection하여 특정 HDAC을 억제함으로써 다시 한번 더 확인하였다. 그 결과, Panobinostat는 IL-6, IL-8 과 같은 IL-1β 유발 염증성 사이토카인과 collagen Iα, collagen 3, α-SMA 및 fibronectin과 같은 TGF-β 유발 섬유증관련 단백질의 생성을 감소시켰다. 또한 갑상선 안와섬유모세포의 지방분화를 억제하였다. Panobinostat는 GO의 안와섬유모세포에서 HDAC7 mRNA 발현을 크게 약화시켰으며, siRNA를 이용하여 HDAC7을 특정적으로 억제시에 항염증 및 항섬유화 효과를 나타냈다. Panobinostat은 in vitro 갑상선 안병증 세포모델이 되는 일차배양 안와섬유모세포에서 HDAC7 유전자 발현을 억제함으로써 염증성 사이토카인과 섬유화 단백질 및 지방의 생성을 억제하였다. 이에 따라 HDAC7은 GO의 염증, 지방생성 및 섬유증 메커니즘을 억제하는 잠재적인 표적이 될 수 있겠다. 향후 임상연구를 통해 약물의 안전성과 유효성에 대한 평가가 필요할 것이다.