Formononetin Inhibits Progression of Endometriosis via Regulation of p27, pSTAT3, and Progesterone Receptor: In Vitro and In Vivo Studies

Abstract

Objectives: Formononetin is one of the phytoestrogens that functions like a selective estrogen receptor modulator (SERM). In this study, we evaluated the effects of formononetin on endometriosis progression in vitro and in vivo. Materials and methods : After pathological confirmation, 10 eutopic and ectopic endometria were collected from patients with endometriosis. Ten eutopic endometria samples were collected from patients who did not have endometriosis. To determine the cytotoxic dose and therapeutic dose of formononetin, the concentration of 70% of the cells that survived after formononetin administration was estimated using a Cell counting kit-8 (CCK 8) assay. Western blot analysis was used to determine the relative expression levels of BAX, p53, pAKT, ERK, pERK, p27, and pSTAT3 in the eutopic endometria without endometriosis, eutopic endometria with endometriosis, and ectopic endometria with endometriosis as the formononetin concentration was increased. We confirmed the effect of formononetin on apoptosis and migration in endometriosis using fluorescence activated cell sorting (FACS) and wound healing assays, respectively. A mouse model of endometriosis was prepared using a non-surgical method, as previously described. The mice were intraperitoneally administered formononetin for four weeks after dividing them into control, low-dose formononetin (40 mg/kg/day) treatment, and high-dose (80 mg/kg/day) formononetin treatment groups. All the mice were euthanized after formononetin treatment. Endometriotic lesions were retrieved and confirmed using hematoxylin and eosin (H&E) staining. Immunohistochemical (IHC) staining of p27 was performed. Results: We set the maximum concentration of formononetin administration to 80 μM through the CCK8 assay. Based on formononetin concentration, the expression levels of BAX, p53, pAKT, ERK, pERK, p27, and pSTAT3 proteins were measured using Western blot analysis (N = 4 per group). The expression level of pERK, p27, and pSTAT3 in eutopic endometrium with endometriosis tended to decrease with increasing formononetin concentration, and a significant decrease was noted at 80 μM. The expression of p27 in ectopic endometrium with endometriosis was also significantly decreased at 80 μM of formononetin. FACS analysis revealed that formononetin did not significantly affect apoptosis. In the wound healing assay, formononetin treatment revealed a more significant decrease in the proliferation of the eutopic endometrium in patients with endometriosis than in the eutopic endometrium without endometriosis. Relative expression of sex hormone receptors decreased with increasing formononetin doses. Although no significant differences were observed in the ER, PR-A, ERβ/ERα, and PR-B/PR-A, significant down-regulation of PR-B expression was noted after formononetin treatment at 80 μM. In the in vivo study, endometriotic lesions in the formononetin-treated group significantly decreased compared to those in the control group. The relative expression of p27 using IHC was highest in the control group and lowest in the high-dose formononetin treatment group. Conclusion: Formononetin treatment was shown to inhibit the proliferation of eutopic and ectopic endometria in patients with endometriosis through the regulation of p27, pSTAT3, and PR-B. In an endometriosis mouse model, formononetin treatment significantly reduced the number of endometriotic lesions with decreased p27 expression. The results of this study suggest that formononetin may be used as a non-hormonal treatment option for endometriosis. 목적: Formononetin은 선택적 에스트로겐 수용체 조절제로 기능하는 것으로 알려진 식물성 에스트로겐이다. 이 연구에서 in vitro 및 vivo 실험을 통해 자궁내막증의 증식에 대한 formononetin의 효과를 평가하고자 한다. 재료 및 방법: 자궁내막증을 진단받은 10명의 환자로부터 eutopic 및 이소성 자궁내막 조직 샘플을 얻었다. 또한 자궁내막증이 없는 10명의 환자로부터 eutopic 자궁내막 조직샘플을 얻었다. Formononetin의 치료 용량을 결정하기 위해 CCK8 분석을 통해 formononetin 투여시 70%의 세포가 생존한 농도를 구했다. 해당 농도까지 formononetin 농도를 증가시키면서 대조군, eutopic 자궁내막, 이소성 자궁내막 세 그룹에서의 BAX, p53, pAKT, ERK, pERK, p27 및 pSTAT3의 상대적 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 측정했다. Formononetin이 세포자연사에 미치는 영향을 확인하기 위해 유세포분석을 시행하였고, 자궁내막증 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 상처회복분석을 시행하였다. 자궁내막증 쥐 모델을 비수술적 방법으로 준비하였다. 대조군, 저용량 formononetin 투여군 (40 mg/kg/day), 고용량 formononetin 투여군 (80 mg/kg/day)으로 나누어 4주동안 매일 formononetin을 복강내 투여하였다. 모든 쥐들로부터 회수한 자궁내막 병변을 헤마톡실린&에오신 염색 및 p27의 면역조직화학염색을 시행하였다. 결과: 우리는 CCK8 분석을 통해 formononetin 투여의 최대 농도를 80 μM로 설정했다. Formononetin 농도에 따라 BAX, p53, pAKT, ERK, pERK, p27, pSTAT3 단백질의 상대적 발현량을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. (그룹당 N=4) 자궁내막증이 있는 Eutopic 자궁내막에서 pERK, p27, STAT3의 상대적 발현량은 formononetin 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향을 보였고, 80 μM에서 유의하게 감소하였다. 이소성 자궁내막에서 p27의 발현 수준 또한 80 μM에서 유의하게 감소하였다. 유세포 분석으로 확인된 세포자연사에 대한 formononetin 투여에 유의한 효과는 없었다. 그러나 상처회복분석에서 formononetin은 자궁내막증이 있는 eutopic 자궁내막에서의 증식을 더 유의하게 감소시켰다. 각 호르몬 수용체의 상대적인 발현은 formononetin 농도 증가에 따라 감소하는 경향을 보였으나, ER, PR-A, ERβ/ERα, and PR-B/PR-A 에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 그러나 프로게스테론 수용체 B(PR-B)의 경우 80 μM의 formononetin 처리시 그 발현이 유의하게 감소하였다. In vivo 연구에서 대조군보다 formononetin 투여군에서 자궁내막증 병변의 유의하게 감소하였다. 면역조직화학염색을 이용한 p27의 상대적인 발현 또한 대조군에서 가장 높았고, 고용량 formononetin 투여군에서 가장 낮았다. 결론: Formononetin 치료는 p27, pSTAT3, 그리고 프로게스테론 수용체 B의 조절로 자궁내막증의 증식을 억제하는 것으로 보인다. 자궁내막증 쥐 모델에서도 formononetin 치료는 자궁내막증 병변의 수를 유의하게 감소시켰다. 이 연구의 결과는 formononetin이 자궁내막증에 대한 비호르몬 치료 옵션으로 사용될 수 있음을 시사한다.