Retinoic acid signaling is required to maintain supporting cell plasticity for differentiation into cochlear hair cells

Abstract

In mammals, during the neonatal period, cochlear hair cells can be regenerated from supporting cells. However, after the neonatal period, hearing loss is irreversible because of lack of regenerative abilities of cochlear hair cells in the postnatal stage. The mechanisms of how supporting cells can regenerate hair cells during early period has not been completely revealed. Retinoic acid (RA), a metabolite of vitamin A (VA), is known to be crucial for the development of various organs, including the inner ear. However, the role of retinoic acid in hair cell regeneration in the postnatal period remains unclear. In this study, I investigated the effect of RA signaling on hair cell differentiation in the postnatal stage using a cochlear organoid model. The process of generating the organoid model consists of two sequential steps: the expansion phase in which supporting cells proliferate and the differentiation phase in which supporting cells are converted into mature hair cells. When I removed VA in the organoid culture medium, hair cell maturation that occurs in the differentiation phase was significantly impaired. When RA was added instead of VA, there was no significant difference in hair cell differentiation compared to the condition of VA in the culture medium, indicating that VA induces hair cell differentiation through RA signaling. To know whether VA is required during either the proliferation of supporting cells or the differentiation of hair cells, I removed VA during the expansion phase or the differentiation phase, respectively. Interestingly, even when VA was provided only during the expansion phase, subsequent hair cell differentiation normally occurred. I found the omission of VA in this critical phase results in a decrease in the expression of essential hair cell maturation transcription factors (TFs) such as Atoh1, Pou4f3, and Gfi1 and subsequent hair cell maturation during the differentiation phase. To activate RA signaling, VA should be converted into RA by enzymes such as retinol dehydrogenases (RDHs) and retinal dehydrogenases (RALDHs). To identify whether supporting cells have those enzymes, I analyzed the mRNA levels of RA synthesis enzymes. I found that supporting cells have their own RA synthesis enzymes. These data suggest RA signaling in the cochlea is required for maintaining the plasticity of supporting cells to differentiate into hair cells. 포유류의 경우, 신생기 동안 달팽이관 유모세포는 지지세포에 의해 재생 가능하다. 하지만, 신생기 이후에는 유모세포의 재생능력이 감소하여 환경에 의한 청력 상실은 되돌릴 수 없다. 지지세포가 생후 초기에 유모세포를 형성할 수 있는 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았다. 레티노산은 내이를 비롯한 다양한 장기의 발달에 필수적인 것으로 알려져 있다. 그러나 출생 후 유모세포 분화에 대한 레티노산의 효과는 명확하게 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 달팽이관 오가노이드 모델을 이용하여 레티노산이 출생 후 유모세포 분화에 어떤 영향을 미치는지 검증해보고자 하였다. 오가노이드 모델은 확장과 분화라는 두 가지 순차적 단계에 의해 형성된다. 먼저, 레티노산 신호전달이 유모세포의 분화에 영향을 주는지 확인하기 위해 비타민A (VA)를 이용해 withdrawal test를 진행하였다. 오가노이드 배양 중에 VA가 없으면, 유모세포 수가 현저히 감소하는 것을 발견했다. 그 다음으로, 확장과 분화 구간 중 어떤 구간에서 VA가 영향을 주는지 확인하기 위해 구간을 나누어 VA를 제거하였다. 흥미롭게도 확장 기간 중에만 VA를 제거했을 때, 분화 기간에 VA를 주더라도, 유모세포 분화에 필수적인 전사 인자의 발현과 그에 따른 유모세포 분화 정도에 영향을 주는 것을 확인 하였다. 그러나 분화 중에만 VA를 제거했을 때는 전사 인자 발현과 유모세포 분화도에 영향을 주지 않았다. 레티노산 신호전달에서, VA는 레티노산 합성 효소인 retinol dehydrogenases (RDHs) 와 retinal dehydrogenases (RALDHs) 에 의해 레티노산으로 변환된다. 지지 세포가 VA를 레티노산으로 전환할 수 있는지 확인하기 위해 확장기간 중 레티노산 합성 효소의 발현을 비교했다. 그 결과, 오가노이드의 VA가 필요한 시기인 확장기에 오가노이드에서 다양한 레티노산 합성 효소가 발현 하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 레티노산 신호 전달이 달팽이관 유모 세포를 형성할 수 있는 지지세포의 가소성을 유지하는 데 중요하다는 것을 시사한다.