Accelerating the evolution of bacteriophages targeting Acinetobacter baumannii in host range expansion and determination of its background genetic mechanisms

Abstract

Prior to the discovery and widespread use of antibiotics, bacteriophages (phages) were a potential solution for preventing and treating bacterial infections (1, 2). With the emergence of antimicrobial resistance, there has been a renewed interest in phages (3). However, a major limitation to using phage as therapy is their narrow host range, limiting their effectiveness to specific bacterial strains of the same species (4). To address this limitation, phage training, such as Appelmans protocol, has been proposed as a strategy for expanding the host range of phages (5). Despite its potential, there are currently no reports of the protocol being applied to phages targeting Acinetobacter baumannii, an opportunistic pathogen responsible for a variety of hospital acquired infections with high mortality rate (6). The aims of my dissertation were to apply the Appelmans protocol for expanding the host range of a phage cocktail targeting A. baumannii and evaluate the therapeutic potential of the expanded host range phages generated from the protocol. Additionally, the genetic mechanism underlying the protocol was also investigated to gain insights into its effectiveness. Chapter I provides a brief overview of Acinetobacter baumannii and highlights the significant global concern surrounding carbapenem-resistant A. baumannii (CRAB) strains. Furthermore, it introduces the fundamental background on bacteriophages and phage therapy, along with their limitations and discusses various approaches to overcome these challenges. Chapter II describes the application of the Appelmans protocol as a host range expansion method to broaden the host range of a phage cocktail targeting CRAB. The assessment of the host range expansion covered both the output cocktail and individual phage clones generated from the method. While the protocol consistently demonstrated the capability to expand the host range of the cocktail, it faced challenges when dealing with CRAB strains. Chapter III delves into the screening and characterization process used to identify potential therapeutic phages. The focus was on evaluating individual phage clones generated from the Appelmans protocol for therapeutic applications. Throughout the evaluation, key factors such as host range stability,lytic growth, transduction potential, and the absence of toxin genes were rigorously examined. However, it is noteworthy that the expanded host range phages obtained from this protocol exhibited limited stability, raising concerns about their suitability for therapeutic purposes. Chapter IV discusses the genetic insights into the Appelmans protocol’s mechanism, not only based on previous studies involving phages targeting different bacterial species but also when applied to the phage cocktail targeting CRAB. A bioinformatics workflow was established to analyze the ancestral of the expanded host range generated from the protocol and the finding revealed that they were recombinant derivatives of prophages induced from encountered bacterial strains. Favorable conditions and explanations for prophage induction during this protocol were proposed to support this genetic mechanism. In conclusion, this dissertation focused on the potential and challenges of a phage training method, especially, the Appelmans protocol in expanding the host range of phages for therapeutic applications. The findings emphasize the importance of understanding the genetic mechanisms underlying phage-host interactions to optimize phage therapy strategies for combating antibiotic resistant bacterial infections. Parts of this dissertation are adapted from Vu TN, Clark JR, Jang E, D'Souza R, Nguyen LP, Pinto NA, et al. Appelmans protocol - A directed in vitro evolution enables induction and recombination of prophages with expanded host range. Virus Res. 2023;339:199272. 항생제를 발견하고 널리 이용하기 이전부터 박테리오파지(파지)가 세균 감염을 예방하고 치료할 수 있는 방법이었습니다. 항균제 내성 문제가 등장하고 확장하면서 파지치료법에 대한 관심이 다시 높아졌습니다. 그러나 파지를 치료제로 사용하는 데 있어 가장 큰 한계는 숙주 범위가 좁아 같은 종의 특정 세균 균주에 국한하여 효과가 있다는 점입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 파지의 숙주 범위를 확장하기 위한 전략으로 Appelmans 프로토콜과 같은 파지 훈련법이 있습니다. 그러나 현재 다양한 의료관련 감염을 일으키는 기회병원균인 Acinetobacter baumannii에 작동하는 파지에 Appelmans 프로토콜을 적용한 보고는 없습니다. 본 논문의 목표는 A. baumannii를 표적으로 하는 파지의 숙주 범위를 확장하기 위해 Appelmans 프로토콜을 적용하고, 숙주 범위가 확장된 파지의 치료 이용 잠재력을 평가하는 것이었습니다. 또한 이 과정에서의 유전적 메커니즘과 그 효과에 대한 연구를 수행하였습니다. 제 1장에서는 A. baumannii에 대한 개요와 카바페넴 내성 A.baumannii (CRAB)의 세계적인 심각성을 조사하였습니다. 또한, 파지와 파지 치료에 대한 배경과 한계점을 조사하고 이를 극복하기 위한 다양한 접근법을 논의하였습니다. 제 2장에서는 CRAB을 표적으로 하는 파지 칵테일의 숙주 범위를 넓히기 위한 숙주 범위 확장 방법으로서의 Appelmans 프로토콜에 대해 설명하였습니다. 숙주 범위 확장에 대한 평가는 결과로 얻어진 파지 칵테일과 생성된 개별 파지 클론을 모두 포함하였습니다. 이 프로토콜을 통하여 칵테일의 숙주 범위를 확장할 수 있었습니다. 제 3장에서는 잠재적인 치료용 파지를 식별하는 데 사용된 선별 및 특성 규명에 대해 자세히 설명하였습니다. 치료 적용을 위해 Appelmans 프로토콜에서 생성된 개별 파지 클론을 평가하였습니다. 평가 전반에 걸쳐 숙주 범위 안정성, 용해 성장, transduction 가능성, 독소 유전자 존재와 같은 핵심 요소를 조사하였습니다. 이 프로토콜에서 얻은 숙주 범위 확장 파지는 제한적인 안정성을 보였고, 따라서 치료 목적에 대한 적합성에 의문을 제기하였습니다. 제 4장에서는 CRAB을 표적으로 하는 파지 칵테일에서의 Appelmans 프로토콜의 메커니즘에 대한 유전적 통찰을 논의하였습니다. 숙주 범위가 확장된 파지를 분석하기 위해 생물정보학 워크플로우를 구축했으며, 그 결과 이들은 세균 균주에서유도된 prophage의 재조합 유도체라는 사실을 밝혔습니다. 이 유전적 메커니즘을 뒷받침하기 위해 prophage 유도에 유리한 조건과 설명을 제안하였습니다. 결론적으로, 이 논문은 파지 훈련법, 특히 치료에 응용하기 위한 파지의 숙주 범위 확장과 이를 돕는 Appelmans 프로토콜의 가능성에 초점을 맞췄습니다. 본 연구 결과는 항생제 내성 세균 감염을 퇴치하기 위한 파지 치료 전략을 최적화하기 위해 파지와 숙주 간 상호 작용의 근간이 되는 유전적 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다는 점을 밝혔습니다.