Antibiotic-treatment induced changes of the allergenicity of cockroach extract

Abstract

The microbiome of the cockroach can be influenced by diet and environmental factors, and it can vary between species. I conducted 16S rDNA-targeted high-throughput sequencing to evaluate the overall bacterial composition of the microbiomes of four cockroach species: Periplaneta americana, P. japonica, P. fuliginosa, and Blattella germanica, which were raised in a laboratory for several generations under the same conditions. Regarding the Shannon biodiversity index, P. americana had a higher microbial diversity than the other species. In phylogenetic indices, the Periplaneta species had a higher microbial diversity than B. germanica. Beta diversity analysis showed that P. japonica and P. fuliginosa had similar microbiome compositions, which differed from that of P. americana and B. germanica. Thus, although microbiome compositions may vary based on multiple conditions, it is possible to identify distinct microbiome compositions among different cockroach species, even when the individuals are reared under the same conditions. I decided to use the German cockroach in the next chapter because the microbiome according to the diet was large and there was an abundance of information on allergens. This PhD thesis aimed to provide more comprehensive effects of antibiotics on cockroach, and development of various extracts from them for future clinical trials. Allergens present in the frass of cockroaches can cause allergic sensitization in humans. The fecal and frass extracts have been previously investigated but have not yet been fully standardized. Antibiotics are known to affect the major allergens and total bacteria in German cockroaches. I treated German cockroaches with ampicillin to produce extracts with reduced amounts of total bacteria. Analysis of the microbiome revealed that the alpha diversity was lower in the ampicillin-treated group than in the control group. Beta diversity analysis indicated that ampicillin treatment altered the bacterial composition in the microbiome of cockroaches. Likewise, quantitative polymerase chain reaction revealed that almost all bacteria were removed by ampicillin-treatment. RNA-seq analysis revealed 1,236 differentially expressed genes (DEGs) in ampicillin-treated cockroaches. Unlike the bacterial composition, the DEGs varied between the two groups. Among major allergens, the expression of Bla g 2 decreased significantly by ampicillin-treatment. The reduced level of allergens observed in cockroaches may be related to lower amounts of total bacteria caused by antibiotic treatment. I conclude that it is plausible to produce an allergen extract with few bacteria for immunotherapy. In chapter II, based on the results obtained in the previous experiment, I examined the altered capacity of antibiotic-treated German cockroaches to induce allergic airway inflammation in a mouse model. At first, I examined the effect of antibiotic treatment on lipopolysaccharide (LPS) and Bla g 1, 2, and 5 expressions in the German cockroach extracts. I then measured the ability of the German cockroach extract (with or without prior antibiotic exposure) to induce allergic inflammation of bronchial epithelial cells in vitro, and the in vivo induction of allergic airway inflammation in mice. A decrease in bacterial 16S rRNA and lipopolysaccharide levels from ampicillin-treatment was confirmed compared with that of the control group. Furthermore, Bla g 1, 2, and 5 expressions in ampicillin-treated cockroaches were decreased at both the protein and RNA levels. In human bronchial epithelial (BEAS-2B) cells exposed to ampicillin-treated German cockroach extract, IL-6 and IL-8 expressions were lower than that in the control group. The total cell and eosinophil counts in the bronchoalveolar lavage fluid were also lower in mice exposed to extracts from ampicillin-treated German cockroaches compared with that in the control group, which was exposed to normal cockroach extract. Mouse lung histopathology showed decreased immune cell infiltration and mucus production in the ampicillin group. Further, IL-4, IL-5, and IL-13 levels were decreased in the lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid, and IgG1 and IgG2a levels were decreased in the serum of the ampicillin group. Overall, ampicillin treatment reduced the symbiont bacterial population and major allergen levels in German cockroaches, leading to reduced airway inflammation in exposed mice. These results will facilitate protein extract preparation for use in immunotherapy or diagnostics, as well as identify environmental issues associated with antibiotic release. 바퀴벌레는 마이크로바이옴에 영향을 미치는 다양한 서식지에 서식한 다. 마이크로바이옴은 식단과 환경적 요인의 영향을 받을 수 있지만 바퀴벌레 종마다 다를 수 있다. 따라서, 16S rDNA-targeted high-throughput sequencing을 통 해서 동일 한 조건에서 여러 세대에 걸쳐 실험실에서 사육된 네 가지 바퀴벌 레 종 (Periplaneta americana, P. japonica, P. fuliginosa 그리고 Blattella germanica) 의 마이크로바이옴의 전체적인 박테리아 구성을 평가했다. Shannon 및 Phylogenetic 지표와 관련하여 B. germanica와 P. americana, P. japonica, P. fuliginosa 와의 큰 차이가 나타났다. 베타 다양성 분석은 추가로 P. japonica와 P. fuliginosa가 유사한 마이크로바이옴 구성을 가짐을 보여주었고, P. americana, B. germanica와 큰 차이를 나타냈다. 따라서 마이크로바이옴 구성은 여러 조건에 따라 다를 수 있지만 동일한 조건에서 사육되는 경우에도 서로 다른 바퀴벌레 종 사이에서 고유한 마이크로바이옴 구성을 식별하는 것이 가능하다. 독일바 퀴벌레가 식단에 따라 마이크로바이옴의 차이가 크고, 알레르겐에 관한 많은 연구가 진행되어 있기 때문에 독일바퀴벌레를 다음 실험에 사용하기로 결정하였다. 바퀴벌레의 분변이나 가루 부스러기에 존재하는 알레르겐은 인간에게 알레르기 감작을 일으킬 수 있다. 면역 요법을 위한 분변 및 가루 부스러기 추출물의 사용은 이전에 조사되었지만 아직 완전히 표준화되지 않았다. 또한 바퀴벌레는 강과 하수구로 배출되는 항생제에 노출된다. 항생제는 독일바퀴 (Blattella germanica)의 주요 알레르겐 및 전체적인 박테리아에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 우리는 독일바퀴에 암피실린을 처리하여 총 박테리아의 양이 감소된 추출물을 생산했다. 마이크로바이옴 분석 결과 알파 다양성이 대 조군보다 암피실린 처리군에서 더 낮은 것으로 나타났다. 베타 다양성 분석은 암피실린 처리가 바퀴벌레의 마이크로바이옴에서 박테리아의 구성을 변경했음 을 나타낸다. qPCR은 암피실린이 처리된 바퀴벌레에서 거의 모든 박테리아가 제거되었음을 보여주었다. RNA-seq 분석은 암피실린 처리된 바퀴벌레에서 1,236개의 DEG를 나타냈다. 박테리아 구성과 달리 DEG는 두 그룹 간에 다양 했다. 주요 알레르겐 중 Bla g 2의 발현은 암피실린 처리된 바퀴벌레에서 유의 미하게 감소하였다. 본 연구에서 바퀴벌레에서 관찰된 알레르겐의 감소는 항 생제 투여로 인한 총 박테리아의 감소와 관련이 있을 수 있다. 면역 요법에 사용하기 위한 굉장히 적은 수의 박테리아가 포함된 바퀴벌레 단백질 추출물 의 추출이 가능했다. 챕터 II에서는, 앞의 결과를 기반으로, 우리는 알레르기성 기도 염증을 유도하기 위해 항생제로 처리된 독일바퀴벌레의 바뀐 능력을 조사했다. 우리 는 독일바퀴벌레에서 lipopolysaccharide와 Bla g 1, 2, 5 발현에 대한 항생제 투여의 효과를 조사했다. 그런 다음 독일 바퀴벌레 추출물이 인간 기관지 상피 세 포와 알레르기성 기도 염증의 마우스 모델에서의 알레르기성 염증을 유도하는 능력을 측정했다. 암피실린을 처리한 바퀴벌레는 대조군에 비해 세균성 16S rRNA와 lipopolysaccharide 수치의 감소를 확인하였다. 암피실린으로 처리된 바 퀴벌레에서 Bla g 1, 2, 5 발현은 단백질과 RNA 단계 모두에서 감소했다. 암피실 린으로 처리된 독일바퀴벌레 추출물에 노출된 BEAS-2B 세포에서 IL-6 및 IL8 발현은 대조군보다 낮았다. 기관지 폐포 세척액의 총 세포 수와 호산구 수 는 일반적인 바퀴벌레 추출물에 노출된 대조군에 비해 암피실린으로 처리 독 일바퀴벌레 추출물에 노출된 마우스에서 더 낮았다. 마우스 폐 조직 병리학 결과는 암피실린 그룹에서 감소된 면역 세포 침윤 및 점액 생성을 보여주었다. 또한, IL-4, IL-5, IL-13은 폐 조직과 기관지 폐포 세척액에서 감소하였고, IgG1과 IgG2a는 암피실린을 처리한 그룹의 혈청에서 감소하였다. 전반적으로 암피실 린 처리는 독일 바퀴벌레의 공생 박테리아 수와 주요 알레르겐 발현 양을 감 소시켜 추출물에 노출된 마우스의 기도 염증을 감소시켰다. 이러한 결과는 면 역 요법 또는 진단에 사용하기 위한 단백질 추출물을 위한 준비를 용이하게 할 뿐만 아니라 강 호수 등에서의 항생제 방출과 관련된 환경 문제를 식별하 는 데 도움이 된다.