Functional roles of polo-like kinase on cell division and flagella biogenesis in Giardia lamblia

Abstract

Giardia lamblia, an early-diverging eukaryote, is a flagellated parasite and causes many cases of diarrheal disease worldwide. The life cycle of Giardia is composed of two forms: an infectious cyst form and a flagellated and proliferative trophozoite form. Each Giardia trophozoite has two nuclei and unique microtubule cytoskeletons that includes eight flagella, basal bodies, adhesive disc, and the median body. Despite these cytoskeletal elements undergo dynamic rearrangements during cell division in G. lamblia, the details of the mechanism are poorly defined. In eukaryotes, the events of cell division are driven by protein kinases, such as the cyclin-dependent kinases, aurora and polo-like kinase (PLK). PLKs are conserved serine/threonine kinases that regulate the cell cycle. In contrast to the five PLKs found in humans, only one PLK is found in Giardia. The role of Giardia lamblia PLK (GlPLK) has not been yet investigated. Therefore, this study aimed to elucidate the role of GlPLK in cell cycle control of G. lamblia. This dissertation is divided into three chapters. The study of evolutionary cell biology as well as comparisons with other model organisms highlights on conserved features and specialized functions among eukaryotes. All of this has allowed for the accumulation of knowledge that provides fascinating perspectives into developmental biology and pathogenicity. Regulatory proteins, several of which have been widely researched in eukaryotic model organisms, function throughout the cell cycle. Among eukaryotic species, such as Trypanosoma brucei and Giardia lamblia, many of these regulatory proteins and their roles are highly conserved. Thus, the first chapter summarized the basic understanding of the cell cycle and its regulation by protein kinases discovered via genetic and biochemical investigations in mammalian cells and other organisms like T. brucei and G. lamblia. This chapter provides insight into the conservation and divergence of genes and various biological processes within eukaryotes. Chapter Ⅱ focuses on investigating the functional roles of GlPLK in cell division of G. lamblia. For this purpose, Giardia trophozoites were treated with the PLK-specific inhibitor GW843682X (GW). After incubating trophozoites with GW, the percentage of cells with more than four nuclei and longer caudal and anterior flagella increased. Using a putative open reading frame for PLK found in the Giardia genomic database, a transgenic Giardia expressing hemagglutinin-tagged GlPLK was generated and used for immunofluorescence assays (IFAs). IFAs indicated that GlPLK was localized to basal bodies and flagella, and was present at mitotic spindles in dividing cells. GlPLK expression was knocked down using an anti-glplk morpholino to observe its effect on the nuclei number and flagella length. Morpholino-mediated GlPLK knockdown resulted in the same phenotypes as those observed in GW-treated cells. Giardia cells ectopically expressing truncated GlPLKs, kinase domain + linker (GlPLK-KDL), or polo-box domain (GlPLK-PBD) were constructed and used for IFAs. In contrast to Giardia expressing GlPLK-PBD, Giardia expressing GlPLK-KDL was defective in its localization to mitotic spindles and had altered localization of the basal bodies in dividing cells. Mutant GlPLKs at Lys51, Thr179, and Thr183 were generated by site-directed mutagenesis, and then used for in vitro kinase assay. Kinase assays using mutant recombinant GlPLKs indicated that mutation at Lys51 or at both Thr179 and Thr183 resulted in loss of kinase activity. Giardia expressing these mutant GlPLKs also demonstrated defects in cell growth, cytokinesis, and flagella formation. Kinesin-13 (Kin-13) is known as a depolymerizer of microtubule (MT). In chapter Ⅲ, Giardia Kin-13 (GlKin-13) is reported as a target of GlPLK for phosphorylation to modulate the flagellar length in Giardia. IFAs of Giardia trophozoites using anti-GlKin-13 antibodies showed labeling of axonemes, flagellar tips and a median body where are also localized by phosphorylated form of GlPLK. Interaction between GlKin-13 and GlPLK was demonstrated via co-immunoprecipitation experiments using transgenic Giardia cells expressing Myc epitope-tagged GlKin-13 and hemagglutinin-tagged GlPLK and in vitro-synthesized GlKin-13 and GlPLK proteins. In vitro-synthesized GlPLK was demonstrated to auto-phosphorylate and to phosphorylate GlKin-13 upon incubation with [γ-32P]ATP. Morpholino-mediated depletion of both GlKin-13 and GlPLK caused an extension of flagella and a decreased volume of median bodies in Giardia trophozoites. In summary, this study has suggested that GlPLK plays a role in Giardia cell division especially during cytokinesis, in addition, it is also involved in flagella formation and median bodies by modulating MT depolymerizing activity of GlKin-13. Thus, this study has provided an understanding on function of GlPLK, concerning regulation of the cell cycle in Giardia, with a particular emphasis on cell division and flagella biogenesis. 람블편모충은 오염된 음식이나 물을 통해 인체에 유입되어 숙주의 소장에서 기생하면서 설사병을 유발하는 원생생물이며, 특히 사람과 동물 모두를 감염시킬 수 있는 인수공통병원체이다. 람블편모충은 두 가지 형태로 생활사를 구성하는데, 단단한 세포벽을 만들어 환경에서 생존하면서 인체에 감염되는 형태인 포낭형(cyst)과 감염 후 숙주의 소장에서 이분법으로 분열하여 병증을 유발하는 형태인 영양형(trophozoite)으로 존재한다. 람블편모충 영양형은 2 개의 핵을 가지며, 미세소관(microtubule, MT)으로 구성되어 있는 8 개의 편모, 흡반 그리고 중심체라는 특징적인 세포골격계들로 이루어져 있다. 람블편모충이 분열할 때, 이러한 특징적인 세포골격계 구조들은 재구성 과정을 통해 2 개의 핵을 유지하며 동일한 두 개의 개체로 분리된다. 따라서 2 개의 핵을 포함한 세포골격계 구조들이 무엇에 의해 조절받으며 어떠한 방식으로 재구성되는지가 중요하다고 생각된다. 진핵생물의 세포분열에 관련된 대표적인 kinase 단백질에는 cyclin-dependent kinase (CDK), polo-like kinase (PLK), aurora kinase (AK), NIMA-related kinase (NEK)등이 있다. 람블편모충에서는 한 개의 PLK 가 존재하는 것이 유전체 분석을 통해 밝혀졌지만, 이 단백질의 특성과 역할에 대한 연구는 진행 된 바가 없었다. 따라서 이 연구는 람블편모충의 세포 주기 조절에서 GlPLK 의 역할을 밝히는 것을 목표로 하였다. 이 논문은 세 개의 장으로 나누어져 있다. 제 1 장에서는 mammalian 세포와 파동편모충, 그리고 람블편모충에서 발견된 kinase 단백질의 보존성과 세포주기 조절에 작용하는 기능을 요약하였다. 제 2 장은 람블편모충의 세포 분열에서 GlPLK 의 기능적 역할을 조사하는 데 중점을 두었다. 이를 위해 람블편모충 영양형을 PLK 특이적 억제제 GW843682X(GW)로 처리하였을 때, 4 개 이상의 핵과 길이가 길어진 편모를 가진 세포의 비율이 증가하였다. Giardia genome database 에서 발견된 PLK에 대한 putative open reading frame을 사용하여 hemagglutinin-tagged GlPLK 를 발현하는 형질전환 람블편모충을 생성하고, 이를 면역형광 형미경으로 관찰하였을 때, GlPLK 가 basal bodies 와 편모에 위치하고 있고, 분열하는 세포에서는 mitotic spindles 에 존재함을 관찰하였다. GlPLK 발현은 anti-glplk morpholino 를 사용하여 저해 시킨 후, 세포의 핵 수와 편모 길이에 미치는 영향을 관찰하였다. Morpholino 를 매개로 한 GlPLK 저해는 GW 처리 세포에서 관찰된 것과 동일한 phenotype 을 보였다. GlPLK 의 kinase domain + linker (GlPLK-KDL) 또는 polo-box domain (GlPLKPBD)을 이소적(ectopic)으로 발현하는 람블편모충을 제작하고 형광현미경으로 관찰 하였다. GlPLK-PBD 를 발현하는 람블편모충과 대조적으로, GlPLK-KDL 을 발현하는 람블편모충은 분열하는 세포에서 mitotic spindle localization 의 결함과 잘못된 위치에 존재하는 basal bodies 가 관찰되었다. Lys51, Thr179 및 Thr183 가 돌연변이 된 GlPLK 는 site-directed mutagenesis 방법으로 제작 한 다음, in vitro kinase assay 에 사용하였을 때, Lys51 또는 Thr179 과 Thr183 이 함께 돌연변이 된 GlPLK 에서 kinase activity 가 저해됨을 확인하였다. 또한 이러한 돌연변이 GlPLK 를 발현하는 람블편모충에서 세포 성장, 세포질분열 및 편모 형성의 결함이 나타남을 관찰하였다. 이러한 결과는 GlPLK 가 세포분열과 편모 생성에 관여함을 나타낸다. Kinesin-13(Kin-13)은 미세소관 depolymerization 에 관여하는 단백질이다. 제 3 장에서는 람블편모충 Kinesin-13 (GlKin-13)이 GlPLK 에 의해 인산화 되는 단백질임을 제시하면서, 이 두 단백질의 상호작용이 람블편모충의 편모길이와 median body 형성에 미치는 영향을 관찰하였다. 먼저 람블편모충 영양형의 세포 내에서 GlKin-13 단백질의 발현 위치를 Anti-GlKin-13 항체를 사용하여 관찰해 본 결과, axonomes, flagellar tip 그리고 median body 에 표지되는 것을 관찰하였고, 이 위치들은 인산화된 형태의 GlPLK 가 발현되는 위치와 일치되는 것을 확인하였다. 형질전환 람블편모충과 in vitro 합성된 GlKin-13 또는 GlPLK 단백질을 사용하여 co-immunoprecipitation 실험을 통해 입증하였다. In vitro 합성된 GlPLK 는 동위원소 [γ32P]ATP 존재 하에 자가 인산화 되고, GlKin-13 을 인산화 시키는 것을 확인하였다. Morpholino 를 매개로 한 GlKin-13 과 GlPLK 두 단백질의 저해는 람블편모충 영양형에서 편모 길이 연장과 median body 의 부피 감소를 야기하였다. 이러한 결과로 GlPLK 가 GlKin-13 의 MT depolymerizing activity 를 조절함으로써 편모 및 median body 형성에 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 이로써, 본 연구를 통해 람블편모충 PLK 가 람블편모충의 편모 길이와 세포분열을 어떻게 조절하는지에 대한 이해를 제공하였다