Novel therapeutic strategies for pulmonary infection caused by Mycobacterium avium complex towards overcoming drug tolerance via metabolic interventions

Abstract

Mycobacterium avium complex (MAC), which typically causes pulmonary disease (PD) in humans, has emerged as the leading pathogen among nontuberculous mycobacteria worldwide. However, the standard three-drug regimen for MAC-PD treatment (a macrolide (e.g., clarithromycin [CLR] and azithromycin), ethambutol [EMB], and rifampicin [RIF]) remain inadequate. Therefore, effective control measures aimed at preventing MAC infection while also accelerating therapeutic efficacy are required. Chapter I of this text discusses how the current anti-MAC drugs modulate host immunometabolism and how drug tolerance and resistance are mediated by the regulation of immunometabolism in MAC-PD patients. Then, the approaches to improving treatment outcomes for MAC-PD through immune and metabolic changes are discussed. Because MAC species such as M. tuberculosis (Mtb), are intracellular pathogens, cellular immune and metabolic responses contribute to the pathogenesis of the disease. It was correlated with a low treatment success rate, indicating that controlling the host condition can improve treatment efficacy, but there have been few studies on the improvement of treatment efficacy for MAC-PD. It is necessary to conduct research on the drug tolerance mechanism and develop therapeutic adjuvants in order to study therapeutic strategies. From chapters II to VI, the studies were conducted with the goal of improving drug efficacy based on host immunometabolism. Though it is known that Th1/Th17 responses are linked to MAC-PD, it has not been established that Th1/Th17 responses can improve drug efficacy. Therefore, chapter II describes the strength of glucopyranosyl lipid-induced Th1/Th17 responses specific to M. avium (Mav). Glucopyranosyl lipid A stable emulsion (GLA-SE) and cyclic-di-GMP (GLA-SE/CDG) immunization are critical for preventative protection against Mav infection but may be ineffective or even detrimental when used in conjunction with antibiotic therapy to treat chronic disease, indicating that different approaches are required for different vaccination purposes. Then, since the treatment failure is still occurred in spite of long-term therapy, the investigation of the reasons of poor treatment outcomes is required. Chapter III reveals that despite low in vitro minimum inhibitory concentration (MIC), bone marrow-derived macrophages (BMDMs) have insufficient intracellular anti-MAC RIF activity and that RIF tolerance in Mav-infected BMDMs is associated with lipid metabolism and the interferon (IFN) response. In comparison to Mtb-infected BMDMs, Mav-infected BMDMs induced glycolysis, triacylglyceride (TAG) synthesis, and increased expression of lipid metabolism-associated genes, while IFN-g response-associated genes were downregulated. Collectively, RIF was ineffective under TAG accumulation conditions, and the combination of IFN-g and RIF indicates the synergetic anti-MAC activity generated by the regulation of lipid homeostasis. Because lipid droplet components are associated with MAC pathogenesis, chapter IV discusses potential metabolites (dimethyl malonate, referred or DMM) as a novel therapeutic component to be used alongside existing anti-MAC drugs. DMM modulates the expression of TAG synthesis and hydrolysis-associated enzymes, as well as the concentration of TAG in Mav-infected BMDMs. Based on transcriptome analysis, acyl-CoA thioestrase 1 (Acot1), a regulator of lipid metabolism that catabolizes acyl-CoA to CoA-SH and free fatty acids (FFA), was significantly down-regulated by Mav infection and restored after DMM treatment. Moreover, ACOT1-overexpressing BMDMs control intracellular Mav growth and modulate the expression of TAG synthesis and hydrolysis-associated enzymes in the same manner as DMM-treated BMDMs. Furthermore, I demonstrated the optimal synergy between DMM and clofazimine (CFZ), which resulted in a strong inhibition of robust lipid accumulation. Chapter V discusses the improved anti-MAC activities associated with incorporating CFZ into the standard regimen (with CFZ replacing RIF). In particular, this finding was based on intracellular activity in a murine model of chronic progressive MAC-PD, where using CFZ as an alternative resulted in better outcomes. When compared to the standard regimen (CLR+RIF+EMB), the CFZ-containing regimen significantly reduced bacterial CFUs in all organs, with particularly notable reductions in lung inflammation. Intriguingly, 2 weeks of treatment with the CFZ-containing regimen decreased bacterial loads more effectively than 4 weeks of treatment with the standard regimen. Therefore, the CFZ-containing regimen also has a treatment-shortening effect. Based on findings discussed in the previous chapters, chapter VI suggests improved combination regimens and metabolic interventions based on studies in macrophages and murine models of chronic, progressive, macrolide-resistant MAC-PD. Following intracellular anti-MAC activity testing of several drugs, CFZ and bedaquiline (BDQ) were selected because they demonstrated the most effective synergetic anti-MAC activity in combination with DMM. Therefore, when compared to the standard regimen (CLR+RIF+EMB), the inclusion of CFZ, BDQ, and DMM (as alternatives to CLR) in the treatment regimen resulted in a more favorable outcome in the animal model of chronic, progressive, macrolide-resistant MAC-PD. Intriguingly, 3 weeks of the alternate drug treatment reduced bacterial loads in the lungs and spleen more effectively than the standard regimen in MAC-infected mice. Thus, CFZ, BDQ, and other metabolic interventions may be recommended for patients with macrolide-resistant MAC-PD. Taken together, these studies describe the optimal combination regimens, demonstrating drug tolerance mechanisms involve in the host and bacterial interaction, and improving treatment outcomes through metabolic interventions (rather than immune response) using anti-MAC drugs. These works may also be useful in addressing the treatment limitations associated with macrolide-resistant MAC-PD. 비결핵항산균(Non-tuberculous mycobacteria, NTM)은 결핵균 복합체(Mycobacterium tuberculosis complex), 나병균(M. leprae)을 제외한 항산균을 총칭한다. 비결핵항산균은 토양, 물, 상수도 시스템 등 자연과 환경에 존재하고 있으며 사람에게는 언제든지 질병을 유발시킬 수 있는 기회감염균들이다. 전세계적으로 비결핵항산균 감염증에 의한 사망률과 유병률은 증가하는 추세이며 우리나라에서도 비결핵항산균에 의한 사망률과 발병률이 빠르게 증가하고 있다. 비결핵항산균은 사람에게 주로 폐질환을 일으키지만 파종성 질환, 림프절 감염, 피부 질환, 그리고 매우 적은 비율로 뇌 질환까지도 일으킨다고 보고되고 있다. 비결핵항산균은 현재까지 200여종이 공식적으로 보고되었고 그 중, M. avium과 M. intracellulare로 구성된 M. avium complex (MAC)은 사람에서 가장 심각한 피해를 주고 있는 대표적인 비결핵항산균종으로 보고되고 있다. 비결핵항산균은 특이하게도 65세 이상, Body Mass Index (BMI) 지수가 낮은 중년의 여성에서 많이 발병하는 것이 임상표현학적 특징이다. MAC 폐질환은 진단 후, 환자의 증상과 방사선학적 소견을 바탕으로 치료 시작여부를 결정하며 일단 치료가 시작되며 균음전(Negative conversion)이 완료된 이후에도 12개월 이상, 항생제로 치료한다. 현재 사용 중인 약제로는 가장 중요한 핵심 항생제인 macrolide (clarithromycin (CLR) 또는 azithromycin)을 포함하여 ethambutol (EMB)와 rifampicin (RIF)을 병용 투여하도록 권장하고 있다. 이외에도, streptomycin, amikacin, clofazimine (CFZ), linezolid 등의 항결핵제가 2차 약제로 사용되기도 한다. 하지만 현재까지 MAC 폐질환의 병인 기전이 명확하게 규명되어 있지 않으며 고령의 환자에게 긴 치료기간이 요구되고, 환자 개개인의 질병진행 정도가 달라서 치료에 많은 어려움이 있다. 따라서, 장기 투여에도 불구하고 치료 실패, 재발, 재감염, macrolide 내성, 사망 등의 문제가 지속적으로 발생하고 있어, MAC 폐질환 환자의 치료향상을 위한 기초적인 연구와 새로운 치료전략이 요구되고 있다 따라서 본인의 학위에서는 아래 총 5가지 중전연구분야를 설정하고 MAC 폐질환의 새로운 치료전략을 제시하고자 하였다. 제1장에서는 현재 MAC 폐질환 치료에 사용 중인 항생제들의 생물학적 기능에 대한 문헌 고찰과 NTM 폐질환 환자의 면역대사에 기인한 항생제 관용성, 저항성을 다루었으며 이를 토대로 새로운 해결 방안을 제시할 수 있는 최신 연구동향을 소개하였다. MAC 균종들은 결핵균(M. tuberculosis)과 마찬가지로 세포 내 기생세균으로 세포의 면역-대사 반응이 병인기전에 기여하는데, 최근에는 MAC 폐질환 환자의 경우, BMI 지수가 낮은 환자가 그렇지 않은 환자에 비해서 치료 성공률이 낮은 것을 확인하였다. 즉, 숙주 내 환경을 조절하는 것이 치료 효율을 높일 수 있음을 시사하고 있지만, 아직 MAC을 비롯한 NTM 폐질환에 대한 치료 효능 증진 관련된 연구가 적어 기존 항결핵제를 활용한 최적의 치료제 조합, 기존 치료제의 관용 기전, 그리고 치료 증강제 개발 연구를 통한 치료 전략 연구가 필요하다. 제2장부터 6장까지는 면역-대사 반응 기전 연구를 바탕으로 기존 항생제의 효능을 극대화하는 것을 목표로 연구를 수행하였다. 2장에서는 Th1/Th17 T 세포 반응이 MAC 폐질환 및 치료반응과 관련성이 있는 것으로 알려져 있지만, 치료 중에 면역 반응을 높이는 것이 치료에 어떤 영향을 미치는지 밝혀진 바가 없어, 마우스 모델을 활용하여 예방 백신 및 치료 백신 연구를 진행하였다. 주로 결핵 치료 백신에서는 치료 완료 후 또는 치료 중에 접종하여 숙주의 항결핵 면역반응을 높여 재감염과 재발을 막고 치료 기간을 단축하는 효능을 보인다고 알려져 있다. 본 연구에서는 예방 백신으로 마우스 모델에서 culture filtrate antigen adjuvanted with glucopyranosyl lipid A stable emulsion plus cyclic-di-GMP (CFA+GLA-SE/CDG) 처리 후, M. avium 감염 하는 경우에는 Th1/Th17 반응 증진과 함께 균 수 및 병변이 감소하였지만, 치료 백신으로 M. avium 감염 후 CLR과 동시에 CFA+GLA-SE/CDG를 처리하였을 때는 Th1/Th17 반응이 증진되어도 시너지 효과가 나타나지 않았다. 이를 통해 감염 후에는 면역 반응 증진이 약물의 효능에 도움이 되지 않는 것을 확인하였다. RIF는 현재까지 MAC 폐질환 치료의 3번째 중요 항생제로 인식되었으나 최근 macrolide의 혈중 농도를 낮춘다는 보고 등 RIF 사용에 대한 임상적 부정효과 들이 보고되고 있다. 본 학위 제3장에서는 MAC 균종들이 RIF에 대하여 낮은 in vitro MIC를 나타낸 반면, 세포 내에서는 RIF 관용을 나타냄을 확인하였고 이를 토대로 연구를 진행하였다. 이는 큰포식세포 내에서 MAC 균종들이 감염 후, 일어나는 항생제 관용이기 때문에, 감염 후 변화하는 숙주의 대사기전이 RIF의 세포내 항생제 관용에 관여한다는 가설을 뒷받침하는 것이다. 이를 증명하기 위하여 M. avium과 결핵균이 감염된 큰포식세포의 대사체를 liquid chromatography triple quadrupole tandem mass spectrometry 와 ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)로 비교하였을 때, M. avium 감염 시, 큰포식세포의 glycolysis 대사와 지질 대사가 빠르게 유도되었으며, 특히 triacylglycerides (TAGs) 지질들의 축적이 두드러지게 관찰되었다. 또한 전사체 분석하였을 때, 결핵균 감염된 큰포식세포 대비 M. avium 감염된 큰포식세포내에서 지질 대사 관련 유전자들의 발현은 증가하였지만, type I interferon (IFN) 관련 유전자들의 발현은 감소하였다. 흥미롭게도, M. avium이 감염된 큰포식세포에서는 RIF 처리 시 축적된 TAG 지질들의 대사가 조절되지 않는 것을 확인하였으며, IFN-b와 RIF 함께 처리하였을 때, TAG 지질들의 합성과 분해 관련 유전자들이 같이 조절되는 것을 확인하였고, 이로 인해 RIF의 효능이 다소 증진되는 것을 확인하였다. 즉, 과도한 TAG 지질들의 축적은 RIF에 대한 세포 내 항생제 관용을 유도하였고, 이를 낮추는 물질을 약물의 증강제로 사용할 경우 항생제의 관용을 억제하여 시너지 효과가 나올 것으로 예상된다. 제4장에서는 M. avium 감염된 큰포식세포에서 TAG 지질들이 크게 증가하는 것을 토대로 지질 대사 조절이 항생제의 효능을 높이는 것을 확인하고자, glycolysis 후 지질 대사 합성 경로에 사용되는 citrate와 malonyl-CoA의 전구체로 사용될 수 있는 dimethyl malonate (DMM)의 효능을 알아보고 그 기전을 규명하였다. DMM은 자체적으로도 세포 내 M. avium 제어 효능이 있었고, 이를 UPLC-MS/MS를 통해 지질체 분석을 진행하였다. M. avium 감염된 큰포식세포에서 TAG 지질들이 Naïve 상태의 큰포식세포 대비 유의미하게 증가하였고, DMM 처리 후 큰포식세포내의 TAG 지질들이 M. avium 감염된 큰포식세포 대비 감소하였으며, 이와 관련하여 TAG 합성 및 분해 유전자들의 발현도 증가하였다. 또한, 전사체 분석을 통해 DMM이 직접적으로 조절하는 유전자의 발현을 확인했는데, M. avium 감염된 큰포식세포에서 acyl-CoA를 free fatty acids로 분해하는 acyl-CoA thioesterase 1 (Acot1)의 발현이 크게 감소하다가 DMM 처리로 회복되었다. ACOT1 과발현을 유도했을 때 DMM을 처리했을 때처럼 TAG 합성 및 분해 유전자들의 발현도 증가했고, 결론적으로 TAG를 분해하였을 때 큰포식세포내에서 효과적으로 M. avium의 생장을 억제할 수 있음을 밝혔다. 이에 따라 DMM과 약물 간의 시너지를 평가했을 때 현재 사용중인 CLR, RIF, 그리고 EMB 보다 인간 단핵구 세포주내 지질의 축적을 억제한다고 알려진 CFZ과의 시너지가 가장 좋았고, 본 연구에서도 TAG를 포함하는 중성 지질을 염색할 수 있는 BODIPYTM 493/503 형광을 이용하여 DMM과 CFZ 동시 처리시 중성 지질의 축적이 억제됨을 확인하였다. 즉, 3장에 이어서 TAG 지질들의 축적을 억제하는 항생제 또는 물질을 사용하면 치료 효능을 높일 수 있음을 다시 검증하였다. 제5장에서는 큰포식세포에서 효능이 낮은 RIF을 대체할 약물로써 처음으로 CFZ을 CLR과 EMB와 함께 사용하여 큰포식세포와 동물 감염 모델에서 약제 조합 평가를 진행하였다. CFZ은 큰포식세포내 MAC 폐질환의 핵심 약물인 CLR과 비슷한 수준의 높은 MAC 균종 제어 효과를 보였으며, 총 6개 MAC 균종에서 CLR과 EMB와 함께 투여했을 때, RIF보다 모두 더 좋은 시너지 효과를 나타냈다. 이를 토대로 M. avium에 감염된 BALB/c 마우스 모델에서 CFZ을 포함한 약제 조합 평가를 진행하였는데, 현재 사용하고 있는 약제 조합(CLR-EMB-RIF)을 투여한 그룹보다 RIF을 대신하여 CFZ를 포함한 약제 조합을 투여한 그룹에서 더 빠르게 치료되었다. 이로써 CFZ을 포함한 약제 조합은 MAC 제어 및 염증 완화를 유도하여 RIF을 대체할 만한 약제로서의 가능성을 제시하였다. Macrolide에 대해 내성을 획득한 MAC 폐질환 환자들의 치료에서 핵심 항생제인 macrolide 항생제의 사용여부는 아직도 논란이 있다. 제6장에서는 위 연구들을 토대로 약제 조합을 구성하여 효능 평가를 진행하였다. 우선 7가지 약물 중 자체적으로 macrolide 내성 균 수를 줄일 수 있는 3가지 약물(CFZ, bedaquiline (BDQ), 그리고 moxifloxacin)을 선정하였고, 대사 조절 증강제로서 DMM과의 시너지를 나타내는 CFZ과 BDQ를 CLR 내성 M. avium에 감염된 BALB/c 마우스 모델에 RIF과 EMB와 함께 투여하였다. 폐 조직 내 균 수를 측정하였을 때, CLR을 CFZ로만 대체되어도 균 수는 크게 줄어들었고, 추가적으로 BDQ와 DMM을 투여하는 경우에는 폐에서는 CFZ+RIF+EMB와 차이는 없지만 비장에서는 균 수가 더욱 감소하는 것을 확인하였다. 이 연구를 통해 macrolide 내성 MAC 폐질환 비율을 줄일 수 있는 약제 조합 가능성을 제시하였다. 종합적으로, 본 학위 논문에서는 1) MAC 폐질환의 문제점, 숙주와 MAC의 상호작용과 항생제의 특성에 관련된 최신 동향을 파악하여 정리하였고, 2) MAC 감염에 대한 예방 백신 및 치료 백신 효능평가, 3) 숙주 세포내 MAC 치료제에 대한 관용 기전 규명 및 면역-대사 반응을 통한 새로운 치료전략 제시, 4) DMM을 이용하여 대사 중재를 통한 현재 사용 중인 항생제 효능 증대 기전 규명, 5) RIF을 대체할 약물 후보로써 CFZ의 세포 및 동물 감염 모델에서의 효능 평가, 6) macrolide-내성 MAC 감염의 효율적 치료를 위한 약제 조합 제시 및 평가에 관한 연구를 수행하였다. 본 연구를 통해, MAC 폐질환의 치료는 면역-대사 조절을 통한 치료 향상이 가능하다는 결과를 제시할 수 있었고, 이와 함께 확인된 약제 조합들은 추후 macrolide 감수성 및 내성 MAC 폐질환의 효율적인 치료기법 개발에 있어서 기초학문적으로 기여할 수 있을 것이다.