Investigation of ocular biomarkers and their mechanism in the Alzheimer’s disease using multi-omics approach

Abstract

Purpose: Alzheimer’s disease (AD) is the most common etiology of neurodegenerative disease worldwide which unfortunately has no known effective treatment to date. Despite CSF and PET are widely used as screening tool for diagnosis of AD, they have limited sensitivity and specificity, and high cost, and invasiveness. To overcome these limitations, a sensitive screening biomarker of AD measurable at an early stage of the disease are essential. Since eyes are central nervous system extensions with brain structure similarities, brain-eye systems (retina, optic nerve, visual cortex, hippocampus) can reveal efficient early-stage biomarkers. Visual system changes were observed, such as structural and functional abnormalities of retina, and sequential brain-eye system proteomic changes in 5xFAD mice. Proteomic profiling pinpointed biomarkers in human and mouse aqueous humor (AH) proteomes. Method: Female 5xFAD mice were used as transgenic AD model mice. Morphological and functional changes of retina were accessed by OCT (optical coherence tomography) scanning and electroretinography (ERG). Both 5xFAD and wild-type mice (WT) were assayed at 3, 6 and 10 months of age (n = 12, n = 26, n = 18). RNA-sequencing analysis was performed using retina and optic nerve of 5xFAD mice at 3 and 10 months of age (n = 10). Quantitative proteomic analysis was conducted using tissues of retina, optic nerve, visual cortex, and hippocampus of 5xFAD mice at 3 and 10 months of age (n = 20). Proteins commonly altered in AH of AD patients (n = 20) and 5xFAD mice (n = 20) were investigated using proteomics analysis. Results: OCT and ERG demonstrated retinal degeneration. Compared to 3-month WTs, RNFL/GCL thickness declined and photoreceptors experienced dysfunction. Sequential proteomic brain-eye system changes confirmed intermediate filament involvement in early AD and gliogenesis late AD. At 3 months, integrated transcriptomic and proteomic analysis of the retina and optic nerve indicated extracellular matrix-involved protein changes; visual perception altered at 10. AH data from AD patients, 5xFAD mouse, and AD-associated gene database determined 5 biomarker proteins (PRDX6, PLG, SERPINF2, CPE, APOA4). Conclusion: We confirmed that visual abnormalities occur from the early stage of AD in 5xFAD mice. We presented more promising biomarkers via integrated analysis of transcriptome and proteome data in intraocular tissues, as well as proteomic analysis of various region such as brain, eye tissues, and biofluids. 목적: 알츠하이머 치매(Alzheimer’s disease; AD)는 가장 흔한 신경 퇴행성 질환 중 하나로, 심각한 신체활동의 영구적인 문제를 일으키므로, 환자 개인만의 질환을 넘어서 사회 경제적 노동력 손실을 유발하게는 심각환 질환군이다. 알츠하이머병과 같은 만성 뇌신경손상은 비가역적 질환으로 뇌신경계 퇴행의 진행을 막기 위해서는 조기 진단을 통한 빠른 치료 결정이 중요하다. 현재의 뇌신경계 질환의 조기 진단을 위한 방법은 MRI, PET 등의 초고가 검사들이 전부이며, 뇌척수액 검사는 매우 침습적이며 결과 또한 부정확하다. 안구는 뇌신경계와 직접적으로 연결되어 있는 유일한 외부 장기이자 뇌의 연장이라고 볼 수 있다. 또한 망막은 신경관에서 파생되어 발생학적으로 뇌 조직과 많은 유사점을 공유하고 있어, 잠재적인 조기진단 타겟이 될 수 있다. 본 연구는 첫번째로 알츠하이머 발병 마우스에서 시기능 검사를 통하여 질병 초기에서 시기능 이상이 나타났음을 확인 하고자 하였으며, 두번째로 해마, 시각피질, 망막과 시신경 조직의 질량분석기반 단백체 분석을 통하여 알츠하이머 쥐의 안구-뇌 연관 생분자 마커의 기전을 규명하고, 이를 망막과 시신경의 전사체와 통합적으로 분석하고 검증함으로써 새로운 알츠하이머 바이오마커 후보물질을 제시하고자 하였다. 마지막으로, 접근성이 용이한 안내 방수를 이용하여 AD 환자와 마우스 모델에서 공통적으로 변화하는 단백체를 분석함으로써 더 정확성이 높은 바이오 마커 후보물질을 제시하고자 하였다. 방법: 모든 실험에서 암컷 5xFAD 마우스를 유전변이 AD 모델 마우스로 사용하였다. 시각 기능 표현형 검사 시스템은 ERG 와 OCT 를 통하여 알츠하이머 유발 암컷 마우스에서 3, 6, 그리고 10 개월까지 연령에 걸쳐 망막의 구조적, 기능적 이상을 관찰하였다 (n = 12, n = 26, n = 18). 알츠하이머 모델 쥐 각 3, 10 개월령에서 (n = 20) 알츠하이머병 진행단계에 따른 쥐의 해마, 시각피질, 망막, 시신경 조직 유래 단백체 정성/정량 분석하고 기 확립된 단백체 분석 플랫폼을 활용하여 글로벌 단백체를 분석하였다. 또한, RNA-sequencing 기법을 통하여 망막과 시신경의 전사체를 분석하였다 (n = 10). 바이오 마커 검증을 위해, AD 환자와 마우스 모델의 방수의 글로벌 단백체를 추가로 분석하였다 (n = 10). Bioinformatics 기법을 활용한 단백질 간 네트워크 기전을 분석하고, 전사체와 통합적으로 분석하여 검증함으로써 알츠하이머병 특이적인 안구 조직 및 방수 내 생분자 마커 후보군을 도출하였다. 결과: AD 마우스는 증상이 나타나지 않는 질병 초기 단계에서부터 아밀로이드 베타가 침착되었으며, 시각 기능의 구조적 기능적 이상을 보였다. 망막과 시신경의 전사체 분석 결과, 각각 신경세포 발달과 혈관신생 관련 생물학적 경로가 유의하게 증가하였으며, 면역 반응과 G 단백질공역수용체 관련 단백체들이 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, 단백체 분석 결과에서는 망막에서 염색체 응축과 시각시스템 발달관련 단백체들이 증가하였으며, 시지각 관련 생물학적 경로가 감소하는 경향을 나타내었다. 시신경의 단백체는 미세섬유 및 중간섬유 관련 과정이 증가하였고, 피부 분화 및 탄수화물대사 관련된 단백체들이 감소경향을 나타냈다. 전사체와 단백체에서 동시에 유의한 변화를 나타내는 바이오마커 후보군들은 망막에서 Col2a1, Crybb2, Rpe65, Ezr 이었으며, 시신경에서는 Dcn, Dpt, Col6a2, Cryaa, Ttr, Cryaa, Pde6a, Prph2 였다. 시각과 관련된 뇌의 메커니즘을 확인하기 위해 해마와 시각피질의 단백체 변화를 분석한 결과,해마에서는 초기에서부터 변화가 크게 있었던 반면 시각 피질에서는 질병 후기에 변화하는 단백체가 더 많았고 이는 아밀로이트 베타가 시각피질에서는 질병 후기에 더 많은 영향을 주는 것을 나타낸다. 해마와 시각피질에서 GFAP,APOE 와 같은 아밀로이드 베타 및 신경아교세포 발생관련 단백체가 증가하였으며, 시냅스 전달 관련 기능이 감소하는 것을 확인하였다. AD 환자 및 마우스 모델의 방수 단백체 분석 결과, 공통적으로 변화하는 바이오마커 후보군들은 각각 PRDX6, PLG, SERPINF2, CPE, APOA4 였다. 결론: 본연구를 통하여 첫째, 5xFAD 마우스를 이용하여 시각 기능이 질병 초기에서부터 발생됨을 확인하였고, 둘째, AD 마우스 모델의 망막, 시신경, 시각 피질, 해마의 질병 단계별 단백체 분석을 통하여 변화하는 메커니즘을 확인하였으며, 망막과 시신경의 시각 시스템에서 전사체와 단백체를 동시에 분석함으로써, 바이오마커 후보군들을 제시하였다. 마지막으로, AD 마우스의 안구-뇌 조직 및 방수 에서 공통적으로 발현되는 단백체를 확인하였으며, AD 환자 방수검체에서도 같은 패턴으로 증가되는 것을 검증함으로써 보다 신뢰성 있는 바이오마커 후보군을 제시하였다.