Beneficial effects of commensal microbes against enteric infection and inflammatory bowel disease

Abstract

"Gut microbiota is closely related to the health status of the host. Maintaining the balance of intestinal microflora plays a crucial role in maintaining the healthy state of the host. When the balance of these intestinal microflora is disrupted, it is called dysbiosis. In the dysbiosis state, the intestinal microflora becomes vulnerable to infection by external pathogens when “colonization resistance” maintained by healthy gut microbiota is damaged. First, we describe a defense strategy against enteric pathogens using intestinal symbionts. (Chapter 1) Vibrio cholerae is a causative strain of cholera that leads to dehydration accompanied by acute diarrhea. However, V. cholerae infects humans but not mice. The lack of well-established mouse models has been a major hindrance in cholera research. Therefore, we first attempted to establish a V. cholerae mouse model. It was confirmed that treatment with an antibiotic called clindamycin (CL) makes the intestine more susceptible to cholera infection with changes in the intestinal microflora. CL is an antibiotic that selectively kills anaerobic strains of several bacteria. Intestinal microorganisms are composed of several anaerobic bacteria. When CL is administered, many microbes present in the intestine disappear. When mice were treated with CL, it was confirmed that the most remarkably decreased microorganisms were members of the Bacteroides family. The number of microorganisms belonging to Proteobacteria increased. Infection was confirmed after the mice were infected with V. cholerae. Thus, we established a mouse model of V. cholerae infection using CL. Here, we hypothesized that V. cholerae infection was caused by the altered gut microbiota. We believed that V. cholerae infection would occur in the gut microbes treated with CL. Therefore, CL-treated feces from mice were transplanted into germ-free (GF) mice to confirm infection with V. cholerae. Infection with V. cholerae was verified only in GF mice transplanted with CL-treated feces. This showed that the infection of V. cholerae was caused by changes in the intestinal microbiota. Here, we confirmed whether the infection of V. cholerae was caused by any of the altered intestinal microbes. It was hypothesized that Bacteroides vulgatus, which showed the highest change when treated with CL, might be associated with infection with V. cholerae. Considering that V. cholerae infection occurred in an environment where B. vulgatus disappeared, it was supposed that a correlation between B. vulgatus and V. cholerae existed. The correlation between the two bacteria was confirmed in GF mice. As a result, we showed that the infection of V. cholerae was inhibited when B. vulgatus was present. Thus, we confirmed that the distribution of intestinal microbes changed when CL was applied. The greatest change was found in B. vulgatus, which is predominantly present in the gut microbes of mice. Infection with V. cholerae was confirmed when changes in intestinal microflora were induced. We investigated how the altered gut microbiota was involved in the development of V. cholerae infection. It was believed that V. cholerae infection was regulated by any environment created by the changed intestinal microbes. Therefore, we tried to identify the environment. The intestinal environment is changed by specific metabolites present in the intestinal microbes. Infection is thought to occur because of this with a focus on metabolites. We found that the metabolites of the intestinal environment induced by changes in the intestinal microbial flora changed the conditions for the proliferation and colonization of V. cholerae, making the intestine vulnerable to infection. While Chapter 1 discusses the importance of commensal microbes in intestinal infections, Chapter 2 addresses the importance of commensal microbes in inflammatory bowel disease (IBD). IBD is a condition in which inflammation is chronically induced in the intestine. According to the location of inflammation, IBD is classified into ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD), both of which are chronic inflammatory bowel diseases. Fecal transplantation is often used to treat IBD. By transplanting microorganisms that exist in the intestines of healthy people into patients, the intestinal microorganisms in the dysbiosis state become healthy. Although fecal transplantation is an effective treatment, it has many side effects. Various microorganisms present in the gut are known to us, but some microorganisms remain unknown, which may cause side effects. We created a Major Gut Microbes among Korean (MGMK) strain consortium to alleviate these side effects. It was anticipated that side effects could be alleviated if fecal transplantation was performed using well-known strains. The MGMK strains were selected based on the strains that have been extensively studied among Koreans. We transplanted this MGMK strain into GF mice and investigated how each strain competes for colonization. As a result, we confirmed that Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, and Ruminococcus faecis were present predominantly. It was confirmed that each strain colonized for 33 days. These three strains were predominantly present around 1 day after strain transplantation and were predominant until the end of the experiment. We named these three strains Strong Intestinal Colonizer 3 (SIC3). SIC3 was used to verify whether these strains could alleviate IBD. Dextran sulfate sodium (DSS) was administered to mice to create a colitis model. It was confirmed that symptoms were alleviated by treatment with SIC3. When the efficacy of SIC3 was confirmed using several indicators, such as the disease-associated index (DAI), it was found that symptoms were significantly reduced in the group administered SIC3. In other words, it could be verified that SIC3, a commensal microbe, played a significant role in treating IBD. Overall, it was confirmed that enteric infections can be controlled by commensal microorganisms in the relationship between enteric infections and commensal microorganisms, as described in Chapter 1. In Chapter 2, the possibility of symbiotic microorganisms playing a role in the treatment of IBD was also confirmed.

장내 미생물은 숙주의 건강상태와 밀접하게 연관되어 있다. 그렇기 때문에 장내 미생물 균총의 균형이 유지된다는 것은 숙주가 건강한 상태를 유지하는데 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 어떠한 이유에 의해서 이러한 장내미생물 균총의 균형이 깨지게 되면, 우리는 이를 dysbiosis 라고 부른다. Dysbiosis 상태에서는 외부의 병원성 미생물에 의한 감염에 취약해지는 상태가 된다. 건강한 장내미생물에 의해 유지되는 “Colonization resistance” 가 무너지게 되면 여러 병원성 미생물에 의한 감염에 취약해지게 된다. 먼저 우리는 장내 공생미생물을 이용한 enteric pathogen 에 대한 방어에 대해서 설명할 것이다. (Chapter 1) 비브리오 콜레라 균주는 급성 설사를 동반하여 탈수에 이르게 하는 콜레라를 일으키는 원인 균주로 잘 알려져 있다. 하지만 비브리오 콜레라는 사람한테는 감염이 일어나지만 마우스에서는 감염이 일어나지 않는 특징을 가지고 있다. 마우스 모델이 제대로 확립되어 있지 않다는 점은 콜레라 연구에 있어서 큰 장애물로 작용해왔다. 이에 우리는 먼저 마우스에서 비브리오 콜레라 모델을 확립하고자 하였다. 우리는 여러 항생제를 이용해서 모델을 확립하고자 하였고 처리한 항생제 중 클린다마이신 항생제를 처리하였을 때 효과가 있음을 확인하였다. 클린다마이신을 처리하게 되면 장내 미생물의 변화와 함께 콜레라 감염에 취약해진다 라는 사실을 확인하게 되었다. 클린다마이신은 여러 박테리아 중에서도 혐기성 균주를 선택적으로 죽이는 역할을 하는 항생제이다. 장내 미생물은 여러 혐기성 박테리아로 이루어져 있는데 클린다마이신을 처리하게 되면 장내에 존재하는 많은 미생물이 사라지게 된다. 마우스에 클린다마이신을 처리하였을 때 가장 두드러지게 감소하는 미생물은 박테로이데스 계열의 미생물이 현저하게 사라지며 프로티오박테리아에 속하는 미생물은 증가 되어있음을 확인하였다. 이러한 조건의 마우스에 비브리오 콜레라를 감염시켰더니 감염이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 우리는 클린다마이신을 이용한 비브리오 콜레라의 마우스 모델을 확립할 수 있었다. 여기서 우리는 비브리오 콜레라의 감염이 변화된 장내미생물 균총에 의한 것이다 라는 가정하에 클린다마이신이 처리된 장내미생물에서는 비브리오 콜레라의 감염이 잘 이루어 질 것이라고 생각하였다. 이에 클린다마이신이 처리된 마우스의 분변을 무균마우스에 이식하여 비브리오 콜레라의 감염을 확인하였다. 클린다마이신이 처리된 마우스의 분변을 이식한 무균마우스에서만 비브리오 콜레라균의 감염이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 비브리오 콜레라의 감염은 장내미생물 균총의 변화로 인해 이루어진 것임을 증명하였다. 여기서 우리는 변화된 장내미생물 중 어떠한 것에 의해 콜레라 균의 감염이 이루어지게 되었는지를 확인하였다. 클린다마이신을 처리하였을 때 가장 크게 변화한 Bacteroides vulgatus 가 비브리오 콜레라균의 감염과 연관이 있을 거라는 가설을 세우게 되었다. B. vulgatus 가 사라진 환경에서 비브리오 콜레라균의 감염이 일어난 것을 바탕으로 하여, B. vulgatus 와 비브리오 콜레라 균 간의 상관관계가 존재할 것이라고 생각하였다. 무균마우스를 이용해서 두 균의 상관관계를 확인하였다. 그 결과 B. vulgatus 가 존재할 때 비브리오 콜레라 균의 감염이 억제됨을 확인하였다. 이로써 우리는 클린다마이신을 처리하였을 때 장내미생물 분포가 변하며, 마우스 장내 미생물에 우세하게 존재하는 B. vulgatus 의 가장 크게 변화하는 것을 확인할 수 있었다. 이렇게 장내 미생물의 변화가 유도된 상황에서 비브리오 콜레라균의 감염이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 그 다음으로 우리는 변화된 장내 미생물이 어떻게 비브리오 콜레라균의 감염이 일어나는 데에 관여하는지에 대해 알아보았다. 변화된 장내 미생물이 만들어내는 어떠한 환경에 의해 비브리오 콜레라균의 감염이 조절 된다고 생각하였고, 이에 우리는 그 환경을 찾아내고자 하였다. 장내미생물에 존재하는 특정 대사체에 의해 장내 환경이 변화되고, 그 때문에 감염이 이루어지는 것이라고 생각하고 대사체에 초점을 맞추게 되었다. 장내 미생물 균총의 변화로 유도된 장내 환경의 변화에 의해서 비브리오 콜레라균의 증식, 우점화가 잘 이루어지는 조건으로 변화하게 되면서 감염에 취약해진다는 사실을 확인하였다. Chapter 1이 장내 감염에 있어서 공생미생물의 중요성에 대해 논의했다면 Chapter 2 에서는 염증성 장질환에 있어서 공생미생물의 중요성에 대해서 다루었다. 염증성 장질환은 만성적으로 장에 염증이 유도되는 질환을 의미한다. 이러한 염증성 장질환은 Ulcerative colitis 와 Crohn’s disease 두가지로 나뉘게 되는데, 염증이 유도되는 위치에 따라서 UC 와 CD 로 나뉘게 되는데 둘 다 만성적으로 나타나는 염증성 장질환에 속하게 된다. 염증성 장질환의 치료에는 분변이식술이 많이 이루어진다. 건강한 사람의 장내에 존재하는 미생물을 환자에게 이식해 줌으로써 dysbiosis 상태의 장내미생물을 건강하게 만들어 준다. 분변이식술은 매우 효과적인 치료법이지만 부작용 또한 많이 존재한다. 장내 미생물에 존재하는 다양한 미생물은 우리가 알고 있는 미생물도 있지만 우리가 모르는 미생물 또한 존재하기 때문에 그러한 미생물에 의한 부작용이 존재한다. 이러한 부작용을 줄이기 위해서 우리는 Major Gut Microbes among Korean(MGMK) 라고 부르는 균주 컨소시엄을 만들었다. 우리가 잘 알고 있는 균주를 이용하여 분변이식술을 진행하면 부작용을 줄일 수 있을 것이라고 판단하였다. MGMK 균주들은 한국인에게서 많이 발견되는 균주 중에 많이 연구가 된 균주를 바탕으로 선택되었다. 우리는 이 MGMK 균주를 무균마우스에 이식하여 각각의 균주가 서로 경쟁하여 어떻게 colonization 을 이루는지에 대해 알아보고자 하였다. 그 결과 우리는 Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Ruminococcus faecis 가 굉장히 우세하게 colonization 을 하는 것을 확인하였다. 33일동안 각각의 균주가 어떻게 colonization 을 이루는지 확인하였는데 균주 이식 후 하루 정도 만에 이 세가지 균주가 우세하게 존재하였으며, 실험 종료 때까지도 우세하게 존재하고 있음을 확인하였다. 우리는 이 세가지 균주를 Strong Intestinal colonizer3 (SIC3) 라고 명명하였다. 우리는 SIC3 를 이용하여, 이 균주들이 염증성 장질환을 완화 시킬 수 있는지에 대해 확인하였다. Dextran sulfate sodium (DSS) 를 마우스에 처리하여 colitis model 을 만들고, SIC3 를 처리하여 증상이 완화되는지 확인하였다. Disease associated index (DAI) 등 몇가지 지표를 이용해서 SIC 3의 효능을 확인한 바, SIC3 를 투여한 그룹에서 유의미하게 증상이 감소되었음을 확인할 수 있었다. 즉 염증성 장질환을 치료하는데 있어서 commensal microbes 인 SIC3 가 유의미하게 작용 하였음을 입증할 수 있었다. 종합적으로, chapter 1에서 다룬 enteric infection 과 공생미생물과의 관계에서 공생미생물에 의해 enteric infection 이 조절될 수 있음을 확인하였다. 또한 chapter 2 에서는 염증성 장질환의 치료에 있어서 공생미생물이 작용할 수 있는 지에 대한 가능성 또한 확인할 수 있었다."