Exposure to enriched environment modulates the synaptic vesicle cycle in mice with spinal cord injury

Abstract

enriched environment는 신체적, 인지적, 사회적 자극을 포함한 다양한 자극을 제공하여, 신경 회복 효과를 이끌어 내는 재활치료에 대한 동물 모델이다. enriched environment는 뇌척수 가소성을 촉진하여 동물 모델에서 운동 기능의 향상을 촉진 할 수 있다고 알려져 있으나, 척수손상모델에서 enriched environment에 의한 유전자 발현 차이이 및 전시냅스 가소성에 대한 효과는 아직 밝혀지지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 척수손상 마우스 모델과 비손상 마우스 모델에서 유전자 발현의 차이를 확인한 후, enriched environment가 시냅스 소포 사이클 발현 및 전시냅스 가소성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 이를 위해 생후 7주 된 마우스의 흉추 9번 부위의 척수를 압박 손상을 통해 척수손상을 유발하였으며, 비손상 마우스 모델은 같은 부위의 후궁절제술을 시행하였다. 이후 enriched environment가 미치는 영향을 확인하기 위해, 척수손상 마우스를 enriched environment군과 대조군 (표준 사육환경경군)으로 나누어 총 8주간 사육하였다. 척수손상에 의한 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해, 척수손상 2주 후와 8주 후에 유전자 발현 프로파일링 분석을 시행하였고, 1.5배 이상의 fold-change를 보이는 유전자를 분석하였다. 유전자 발현 프로파일링 분석 결과, 척수손상 2주 후에는 515개의 발현 증가된 유전자와 128개의 발현 감소된 유전자가 확인되었고, 8주 후에는 1,073개의 발현 증가된 유전자와 666개의 발현 감소된 유전자가 확인되었다. KEGG pathway 분석에서는 시냅스 소포 사이클이 척수손상 2주 및 8주에 모두 의미 있게 감소되는 것을 확인하였다. 발현 감소가 확인된 시냅스 소포 사이클에 관계된 Slc17a6, Rims1, Stxbp1, Unc13c, Cplx1, Cplx2, Snap25, Stx1b, Dnm1 유전자들의 발현이 enriched environment 노출에 의해 어떤 차이를 보이는지 확인하고자 qRT-PCR과 Western blot 및 면역조직화학검사를 진행하였다. 또한, 쥐의 신경행동검사를 진행하여 enriched environment 노출에 따른 호전여부를 확인하였다. qRT-PCR 결과, 2주와 8주 모두 척수손상마우스 모델에서 대조군에 비해 높은 유전자 발현을 보였으며, 특히 8주에서는 통계학적으로 의미가 있는 높은 유전자 발현이 관찰되었다. 따라서, enriched environment 노출이 시냅스 소포 사이클 조절을 통해 전시냅스 가소성을 증가시킴을 확인하였다.

An enriched environment (EE) consists of multiple mice in a large cage to increase social interaction and contains various toys, tunnels, shelters, and running wheels to increase locomotor activity. Exposure to an EE is a suitable method for inducing activity-dependent plasticity, and it is considered a similar condition with rehabilitation training in humans. Almost studies examining the effects of EE in the brain injury model revealed postsynaptic plasticity, and there is a lack of published research about presynaptic plasticity in gene expression level after EE exposure. Therefore, the aims of this study are (1) to identify gene expression profile that is focused on synaptic vesicle cycle (SVC) at the different time points after SCI using RNA-sequencing and, (2) to identify whether EE could lead the presynaptic plasticity by modulating of SVC in spinal cord injured mice. We performed RNA-sequencing and transcriptome analysis to characterize global gene expression after SCI at the different time points (two weeks and eight weeks after injury) compared with the sham (laminectomy) group. Differentially expressed genes (DEGs), the result of transcriptome analysis, was then analyzed by a program Database of Annotation Visualization and Integrated Discovery which yielded the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway. And SCI mice were randomly assigned to either EE (SCI-EE) or standard cages (SCI-Control) for 2 or 8 weeks. In transcriptome analysis results, we found 515 up-regulated and 128 down-regulated genes 2 weeks after SCI. Eight weeks after SCI, 1,073 up-regulated and 666 down-regulated genes were found. In particular, the SVC pathway was significantly down-regulated in both time points. To identify whether EE could modulate SVC, we conducted qRT-PCR and Western blot validation of down-regulated genes at 2 and/or 8 weeks after SCI, Slc17a6, Rims1, Stxbp1, Unc13c, Cplx1, Cplx2, Snap25, Stx1b, and Dnm1. The expression results were compared SCI-EE with SCI-Control. Immunohistochemistry for SNAP25 and Syntaxin 1 was also conducted. Basso Mouse Scale test, cylinder rearing test, and open field test were performed for the behavior assessment. Overall, every examined gene expression in SCI-EE was higher than SCI-Control at 2 and 8 weeks after SCI. Especially at eight weeks after SCI, they showed significantly higher expression than SCI-Control. It either decreased or increased by 2 weeks. It means that exposure to EE modulates the SVC in SCI mice, and changes caused by EE exposure are more prominent when exposure is long duration. Neurobehavior evaluations, BMS, cylinder rearing test, and open field test showed dramatic improvement of functional recovery in eight weeks EE. Based on these results, we could assume that EE exposure leads to increased presynaptic activity (neurotransmitter uptake, docking, priming, fusion, and endocytosis) by modulating gene expression related to SVC.