Transcriptomic characteristics of cancer-driver-gene expression and cellular state-wise change in glioblastoma tumorspheres

Abstract

서론: 전사체 분석은 의학적 샘플의 전체적인 모습을 동시에 분석하게 하는 방법론이다. 이 방법론은 단백질을 코딩하는 유전자와 비암호화 유전자까지 분석을 할 수 있게 발달하였다. 최근에는 단일세포 수준의 분석이 가능하여 기존에는 하나의 세포로 여겨졌던 세포명 내에서 다양한 세포의 상태가 나타나는 것이 연구되고 있다. 이러한 다중 세포상태는 기존 세포실험에서 항암약물 등의 효과를 세포생존도 등을 통해 해석하는 방식에 영향을 끼치게 된다. 특히 약물을 세포에 처리할 때, 약한 세포등은 단일세포전사체 분석 과정에서 제외될 가능성이 있으며, 약물에 의해 죽은 세포는 단일세포전사체 라이브러리 준비과정에서 미세유체 채널을 막히게 하여 분석에 어려움을 줄 수 있다. 그렇기에 암세포에서 약물 반응을 다중세포상태를 고려하여 보는 방법은 중요하다. 본 연구에서는 생물정보학 기법을 재구성하여 다중세포상태를 고려하여 세포상태 변화를 계산할 수 있는 방법을 개발하였고 이를 뇌암에 적용하였다. 특히 뇌에 가장 흔하게 발생하는 교모세포종 (GBM)를 연구하려고 한다. 특히 교모세포종 세포는 다양한 연구기관에서 만든 세포가 있는데, 기존 연구에 의하면 세포배양 방법에 따라 세포가 달라 질 수 있다고 알려져 있다. 특히 뇌암세포는 뇌혈관장벽에 의해 혈액에서 분리되어 있다고 알려져 있는데, 기존 암세포배양 방법들은 소태아혈청을 중요하게 사용한다. 특히 제넨텍이나 브로드 연구소의 세포들도 소태아혈청을 이용하여 배양한 세포의 전사체데이터를 공개하고 있는데, 배양법은 뇌종양세포가 기존 미세환경의 특성을 벗어나게 하고, 줄기세포 능력을 잃고 분화된 세포로 변화하게 한다고 하여 세포 배양에 대한 상호간의 연계성을 명확히 알지 못한다. 본 연구는 세브란스병원에서 확립한 교모세포종 종양구 세포 (TS)에 대해서 전사체적 비교 연구를 하여, 다른 기관에서 만든 뇌종양세포와 다른점이 있는지 확인하고, 본 기관에서 확립한 세포를 검증한다. 또한 앞서 개발한 다중세포상태에서의 세포의 변화를 보는 역필터링 방법을 통해서 교모세포종 종양구가 각종 변화물질에 의해 변화하는 양상을 다중세포상태를 고려하여 볼 수 있는지 연구한다. 재료 및 방법: 텔로머라아제 역전사효소 촉진유전자 상의 변이 (TERT)와 종양단백질 P53 (TP53) 변이는 교모세포종의 암발생에 매우 중요한 초기 유전자로 연구되고 있다. 또한 이 두 유전자는 암세포에서 고발현이 나타나서 교모세포종의 마커로 활용될 수 있다. 이 두 유전자의 공발현은 TCGA, GTEx, 브로드연구소의 CCLE, 제넨텍의 암세포 데이터베이스 그리고 세브란스병원 GBM 조직 및 조직기원 종양구 (특히 아이소시트르산 탈수소효소 정상형 GBM)의 데이터베이스를 비교 분석하였다. 세브란스병원 GBM TS는 CCLE의 종양세포가 함께 같은 데이터전처리를 거쳐서 분석이 되었다. 이 두가지 세포 그룹의 차이가 있는 것에 의문을 갖고, GBM TS를 검증하였다. 발현 유전자 기준으로 하나의 교모세포종 종양구를 선택하여 단일세포전사체 분석과 유전자 복제수 변이 분석 등을 진행하였다. 결과: TCGA와 GTEx데이터를 통해서 GBM을 포함한 종양 조직과 일반 정상조직에서 TERT와 TP53의 공발현의 양의 상관관계를 확인할 수 있었다. 세브란스 원발 GBM 조직과 GBM TS에서도 TERT와 TP53의 통계적으로 유의미한 양의 상관관계를 확인할 수 있었다. 그러나 CCLE와 제넨텍의 중추신경계종양세포등을 포함한 대부분의 세포에서 이러한 두 유전자의 상관관계가 확인되지 않았다. 세브란스 GBM TS는 CCLE의 중추신경계종양세포들과의 비교를 통해 대사적으로 다르며 유전자 별 비교를 통해 볼 때에도 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 차이에 착안하여, GBM TS를 종양 조직과의 비교를 통해 검증작업을 진행하였다. GBM TS에서는 조직에서 나타나는 유전자의 발현패턴이 나타나고 있었으며, 해당 유전자는 다음과 같다 (MGMT, IDH1, EGFR, PTEN 그리고PTPRZ1). GBM 조직과 TS의 각각 정확히 일치하는 샘플 간의 비교를 통해서도 다양한 유전자의 발현패턴을 확인하였다. 또한 유전자 변이의 경우 특히 TP53유전자의 변이 패턴이 조직과 GBM TS에서 상당부분 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 여러 GBM TS중에서 EGFR, TP53, MKI67 그리고PTPRZ1를 고발현하는 하나의 샘플을 확인하여 단일세포전사체분석을 진행하였다. 크게 3가지의 세포 상태가 확인되었고, 첫째 상태 또는 클러스터는 신경줄기세포의 유전자발현특징, 두번째 클러스터는 VIM과 GAPDH의 고발현 확인, 세번째 클러스터에서는 TERT와 TP53의 고발현이 확인되었다. 이 세가지 클러스터에 종양외의 다른 세포는 존재하지 않는 것이 유전자 발현 및 염색체 7번의 획득과 염색체 10번의 결실을 통해서 확인할 수 있었다. 결론: GBM TS는 GBM 조직의 전사체적 특성을 따른다. GBM TS의 원발조직과의 비교로 GBM TS는 원발조직의 특성을 반영하는 것을 유전자 발현 및 변이 패턴을 통해 알 수 있었다. 단일세포 전사체 분석에서 거의 동일한 유전체의 복제수 변이양상에도 서로 다른 유전자 발현패턴이 나타남을 확인할 수 있었다. 단일세포 유전자세트를 이용하여 세포상태별 약물반응을 볼 수 있다.

Background: Transcriptome analysis enabled simultaneous snapshot evaluation of mRNA level of the prepared samples. The analysis method evolved to include protein-coding genes and non-coding genes. Furthermore, single-cell-RNA-sequencing revealed multiple cellular states or clusters in a previously established cancer cell line. As the traditional cell experiment assume a cell line is composed of identical cells, the identification of different cellular states would impact the conventional cell viability interpretations. Single-cell-RNA-sequencing on the drug-treated cells may resolve the cellular state issue. However, the technique may add bias, as the vulnerable cell group may disappear in the downstream analysis, or the dead cell may block the microfluidic channels with failure for preparation of library. Thus, a new analytic method that can account for the heterogeneity of cellular states may show cellular state-specific change or cell viability. I developed a simple protocol and applied it to brain tumor research. Glioblastoma (GBM) is the most common brain tumor, and there are independent cell cohorts by the research groups. However, there has been debate over the reliability of the established cells by the identity and by the culture methods. Brain tumor cells are located within the brain and protected from the serum by the blood-brain barrier. As the cell culture medium usually contains fetal bovine serum (FBS), such a condition was regarded as not an intrinsic niche environment for brain tumor cellular models. Tumor cell exposure to FBS was reported to induce fibrotic changes or induce differentiation from stem cell-like status of brain tumor cells. In addition to the Severance GBM cellular model RNA-sequencing database, Genentech and Broad institute applied different culture methods to develop and maintain glioma cells. They publicized RNA-sequencing data of these cells. Here, this dissertation aims to validate the RNA-sequencing data of the spheroid tumor cells of GBM (GBM TSs) that are cultured in the FBS-free culture medium in comparison with FBS-exposed GBM-derived cells as well as the third-party RNA-sequencing databases of glioma cells. I hypothesized that if the cellular model is reliable, the cell model may recapitulate the gene expression patterns and mutation patterns of original tumor tissue. Based on the validation and applying the gene sets from single-cell-RNA-sequencing, the perturbagen (FBS or drugs) effect was calculated from the bulk RNA-sequencing. Methods: Mutations of the promoter of telomerase reverse transcriptase (TERT) and tumor protein P53 (TP53) are widely found in the glioblastoma lineages and regarded as the initial driver of GBM. As these genes are selectively overexpressed in the tumor cells, co-expression of these two genes may screen the reliability of the established GBM cellular models. Co-expression pattern of TERT and TP53 was used as a first pilot test and assessed in the Cancer Genome Atlas (TCGA), Genotype-Tissue Expression (GTEx), Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE), Cancer cell RNA-sequencing database of Genentech, and Severance GBM tissues and tumor-derived tumorspheres (TSs) database. RNA-sequencing data of Severance GBM TSs are compared with CCLE tumor cells. Based on the difference between the two groups of cells, GBM TSs were analyzed and compared with the GBM tissues with gene expression patterns and gene mutation profiles. One single GBM TS sample was selected for the single-cell RNA-sequencing, and multiple cellular states were examined with the single-cell level GBM tissue data. Results: TCGA and GTEx data showed that several tissue entities and tumors, including GBM, show a statistically significant positive correlation between TERT and TP53. Severance GBM tissues and GBM TSs revealed a significant correlation between TERT and TP53. Unlike the Severance GBM TSs, the RNA-sequencing data of most of the tumor cells and central nervous system (CNS) origin tumor cells of CCLE and Genentech were not showing the correlation between the two genes. Severance GBM TSs were compared with the CCLE CNS tumor cells that are processed from the acquired raw data files with exactly the same computational protocols. Metabolic signatures and gene-wise comparison showed differences between the two groups of cells: and it necessitated the validation of GBM TSs with the GBM tissues. GBM TSs, when compared with control human astrocytes, recapitulated the GBM-cortex expression patterns of cancer-driver-genes (IDH1, EGFR, PTEN, and PTPRZ1) and MGMT. Matching samples of GBM tissue and GBM TSs were compared with the gene expression patterns. The mutation profile of TP53 was shared between the GBM original tissues and the matching-tissue-derived GBM TSs. A GBM-derived TS showed at least three different cellular states with common copy number variation signatures (chromosomal 7 gain and 10 loss). The cluster 0 was dominated by cycling cell signatures (UBE2S, HMGB2, CENPF). The cluster 1, the downstream of cluster 0 with RNA velocity analysis, expressed VIM and GAPDH as the dominant genes. The cluster 2 was expressing a relatively high level of GBM-related long-noncoding RNAs (MALAT1, MEG3, NEAT1) and mitochondrial genes. In the post-drug treatment transcriptome analysis, these types of cell clusters are deconvoluted and showed cluster-specific responses differing by treatment. Conclusions: GBM TSs resemble transcriptomic signatures of GBM tissues. Matching samples of tissues and TS revealed GBM TS as a reliable cellular model of GBM tumor cells. Single-cell RNA-sequencing revealed multiple cell clusters with similar chromosomal copy number variations. These multiple cell cluster can be applied to the identification of cellular state-wise responses to a perturbation, such as a drug treatment.