Significance of cortactin as a prognostic factor in biliary cancer and its relevant signaling pathways as a therapeutic target

Abstract

Background and purpose: Biliary tract cancer has poor prognosis and high mortality, and its treatment options are often limited. Moreover, there is a lack of independent predictive factors for patient outcomes. Cortactin (CTTN), a primary substrate of the Src tyrosine kinase, has been implicated in cellular motility and invasion in various types of cancer. In this study, we explored the role of CTTN expression in biliary cancer in both in vitro and in vivo models. We also investigated CTTN expression in biliary cancer patients and its relationship with clinical factors and prognosis. Methods and materials: We established a KKU-M213 biliary cancer cell line with CTTN and tyrosine466-phosphorylated CTTN (pY466-CTTN) double-knockdown. Cancer-associated fibroblasts (CAF) were obtained from a bile duct cancer patient. For the orthotopic models, tumor cells (1 × 107) were injected into the right liver area of 6- to 8-week-old female nude mice. In total, 116 patients with biliary cancer who underwent surgery between 2005 and 2013 were included, and their tissue microarrays were constructed. The patients were divided into two groups according to their pY466-CTTN expression level: low CTTN (histoscore 0–100) and high CTTN (101–300). Results: Upon co-culture with CTTN-knockdown cells, CAF invasion and proliferation were reduced. CTTN-knockdown KKU-M213 cell lines showed decreased invasion, mobility, mRNA expression level of CXCL10 and CCL2, and phosphorylation of MAPK pathway markers, namely p38, MEK, and ERK, compared with the scrambled control cells. Total EGFR levels continued to decrease even after EGF stimulation in CTTN-knockdown cells. However, in the scrambled control, the EGF-induced downregulation of the receptor was both delayed and impaired. In the mouse orthotopic tumor model, the CTTN expression was significantly associated with fibrosis around the tumor. Moreover, patients with higher expression of pY466-CTTN (n = 64) had significantly poorer disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) (median DFS 7 vs. 16 months, p < 0.001; median OS 19 vs. 53 months, p < 0.001). According to Cox-regression multivariate analysis, high pY466-CTTN expression was a significant prognostic factor for DFS (HR, 2.33; 95% CI 1.52–3.57; p < 0.001) and OS (HR: 2.87; 95% CI: 1.78–4.61; p < 0.001). Desmoplasia and CAF infiltration were also more frequent in the CTTN high-expression group. Conclusions: Our results showed that CTTN is significantly associated with the desmoplastic reaction, likely functioning by enhancing the invasion and proliferation of CAF. Patients with higher pY466-CTTN expression had poorer DFS and OS and increased desmoplasia around

목적: 담도암 높은 사망률을 보이는 예후가 좋지 않은 암종이나, 아직까지는 선택할 수 있는 치료가 제한적이며, 예후 예측을 위한 독립적인 요소는 부족하다. Cortactin (CTTN)은 다양한 종류의 암에서 세포 운동성 및 침윤과 연관이 있다고 알려져 있다. 본 연구에서는, 담도암에서 세포 및 동물실험 모델을 통하여 CTTN 발현 여부에 따른 담도암의 특성을 살펴보고, 예후 인자로서 역할을 탐구하였다. 또한 담도암 환자에서 CTTN 발현과 임상적 요인 및 예후와의 관계를 조사 하였다. 대상 및 방법: 우리는 KKU-M213 담도암 세포주를 사용하여 CTTN과 tyrosine466 인산화-CTTN (pY466-CTTN)이 모두 억제된 세포주를 확립하였다. Cancer-associated fibroblast (CAF)는 담관암 환자로부터 얻었다. Orthotopic 모델의 경우, 종양 세포 (1x107)를 6-8 주령 암컷 누드 마우스의 오른쪽 간에 주입하였다. 환자 분석을 위해서는 2005 년부터 2013 년 사이에 수술을 받은 담도암 환자 116 명의 임상 정보와 조직을 활용하였고, 이 환자들의 Tissue microarray를 구축하였다. 환자들은 pY466-CTTN의 발현정도에 따라 두 그룹으로 나누어 분석하였다: Hitoscore 0-100 (CTTN low) vs. 101-300 (CTTN hign). 결과: CTTN의 억제는 KKU-M213 세포주에서 침입과 이동성을 감소시켰다. 또한 CTTN 억제 세포주와 CAF를 함께 함께 배양했을 때 CAF의 침입과 증식이 현저하게 감소하였다. CXCL10 및 CCL2의 mRNA 발현은 scrambled clone에 비해 CTTN 억제 세포에서 현저하게 감소했으며, 이러한 사이토카인은 CAF의 침입 및 증식에 영향을 미쳤다. Western blot 분석에서 MAPK 신호전달체계 물질인, p38, MEK 및 ERK의 인산화도 CTTN 억제 세포에서 감소됨을 보였다. 총 EGFR의 농도는 CTTN 억제 세포에서 EGF 자극을 하였을 때 지속적으로 감소하였으나, scrambled control 에서는 EGF에 자극에 의한 EGFR의 감소는 거의 보이지 않았다. 이종 이식 모델에서 CTTN 발현은 종양 주변의 섬유화와 상당한 연관성을 보였다. 환자분석에서도, pY466-CTTN (n = 64) 발현이 더 높은 환자는 안좋은 무병 생존율 (DFS) 및 전체 생존율 (OS)을 보였다 (Median DFS 7 vs. 16 개월, p <0.001; 및 median OS 19 vs . 53 개월, p <0.001). Cox- 회귀 다변량 분석에서는 높은 pY466-CTTN 발현이 DFS (HR, 2.33; 95 % CI 1.52-3.57, p <0.001) 및 OS (HR 2.87, 95 % CI 1.78-4.61, p<0.001)에 대한 중요한 예후 인자로도 확인되었다. 종양 주변의 결합조직형성 반응과 CAF 의 침윤 또한 CTTN 이 높게 발현된 환자군에서 좀 더 빈번하였다. 결론 : 우리의 결과는 CTTN이 CAF의 침입 및 증식을 강화함으로써 desmoplastic reaction과 유의하게 연관되어 있음을 보여 주었다. 또한 pY466-CTTN의 발현이 높은 환자는 DFS 및 OS가 더 나쁘고 종양 주변의 desmoplastic reaction이 증가하였다. CTTN에 의해 강화 된 EGFR-MAPK 신호전달체계가 이 것과 연관이 있을 것으로 생각된다.