Investigation of novel target proteins for preventing hepatic lipotoxicity

Abstract

Saturated fatty acid (SFA)-induced lipotoxicity is caused by the accumulation of reactive oxygen species (ROS), which is associated with damaged mitochondria and endoplasmic reticulum (ER) stress. Moreover, lipotoxicity is a crucial pathogenic feature of nonalcoholic steatohepatitis (NASH). The KEAP1 (kelch like ECH associated protein 1)-NRF2 (nuclear factor, erythroid 2 like 2) pathway is a pivotal defense mechanism against lipotoxicity. SQSTM1/p62 has a cytoprotective role against lipotoxicity through activation of the noncanonical KEAP1-NRF2 pathway in hepatocytes. However, the underlying mechanisms and physiological relevance of this pathway have not been clearly defined. Autophagy is required for the clearance of protein aggregates or damaged mitochondria to maintain cellular metabolic homeostasis. ULK1 (unc-51 like autophagy activating kinase 1) is involved in the initiation of autophagy; however, its role in lipotoxicity-induced cell death in hepatocytes and mouse liver has not been elucidated. In Part 1, I found that ULK1 potentiates the interaction between KEAP1 and the autophagy receptor protein SQSTM1, thereby mediating NRF2 activation in a manner requiring SQSTM1-dependent autophagic KEAP1 degradation. Furthermore, ULK1 is required for the autophagic removal of damaged mitochondria (mitophagy) and to enhance binding between SQSTM1 and PINK1 (PTEN induced kinase 1), then has cytoprotective role against lipotoxicity. In Part 2, I demonstrated that NRF2-mediated induction of SQSTM1 activates the noncanonical KEAP1-NRF2 pathway under lipotoxic conditions. Furthermore, I identified that SQSTM1 induces ULK1 phosphorylation by facilitating the interaction between AMPK (AMP-activated protein kinase) and ULK1, leading to autophagy activation, followed by KEAP1 degradation and NRF2 activation. Accordingly, the activity of this SQSTM1-mediated noncanonical KEAP1-NRF2 pathway confers hepatoprotection against lipotoxicity in the livers of conventional sqstm1- and liver-specific sqstm1-knockout mice. In Part 3, I found that the noncanonical SQSTM1-KEAP1-NRF2 pathway is activated by PERK (PKR-like ER kinase), one of cellular adaptive unfolded protein response (UPR) sensors which have cytoprotective effects against ER stress, through facilitates the interaction between AMPK and SQSTM1, further direct phosphorylates SQSTM1 in response to lipotoxicity. Moreover, I identified that PERK-mediated the phosphorylation of ULK1 can activate autophagy under lipotoxic conditions. Therefore, PERK prevents lipotoxicity by activating ULK1-SQSTM1 axis-mediated noncanonical KEAP1-NRF2 pathway. Consistently, I found that this PERK-ULK1-SQSTM1 axis-mediated noncanonical KEAP1-NRF2 pathway is activated in the livers of patients with nonalcoholic fatty liver disease, that provide important insights into the clinical significance of this pathway for preventing hepatic lipotoxicity. Collectively, these proteins (ULK1 in part 1, SQSTM1 in part 2, PERK in part 3) could be promising therapeutic novel targets for the treatment of NASH.

과량의 지방 축적으로부터 유발되는 활성산소에 의한 간세포 사멸은 비알코올성 지방간염의 주요 발병 원인이다. 비알코올성 지방간염은 염증 반응이 지속될 경우 간 경변증이나 간암으로 진행될 수 있기 때문에 예방 및 치료가 필요하다. 하지만, 현재까지 비알코올성 지방간염 특이적인 치료제가 없기 때문에, 비알코올성 지방간염의 치료를 위한 새로운 표적 단백질 및 치료제 개발 연구가 중요하다. 정상간에서 비알코올성 지방간염으로의 진행과정은 ‘2-Hit model’로 설명할 수 있다. 먼저 과량의 지방이 축적되어 비알코올성 지방간이 형성된다 (1st Hit). 이로 인해 손상된 미토콘드리아가 축적되고, 활성산소의 발생과 소포체 스트레스 (ER Stress) 및 염증 반응을 유도하여 비알코올성 지방간염으로의 진행을 촉진시키는 것으로 알려져 있다 (2nd Hit). 또한, 비알코올성 지방간염에서는 오토파지 (Autophagy) 활성이 저해되어 있는 특징을 갖고 있다. 오토파지는 축적되는 지방과 손상된 미토콘드리아의 제거를 위해 중요하고, 세포 내에서 축적된 활성산소는 KEAP1-NRF2 pathway가 활성화되어 항산화 유전자들의 발현을 증가시켜 억제한다고 알려져 있다. 특히, NRF2의 활성제는 비알코올성 지방간염 치료제 개발 연구에 이용되고 있다. 따라서, NRF2를 활성화시켜서 세포 내에서 축적된 활성산소를 억제할 수 있고, 지방의 축적과 손상된 미토콘드리아를 제거하기 위해 오토파지를 활성화시킬 수 있는 단백질이 있다면 비알코올성 지방간염 치료에 효과적인 표적 단백질이 될 것이라 예상하여 연구하였다. 본 연구 1부에서, 오토파지 개시 단백질로 알려진 ULK1이 선택적 오토파지 수용체로 알려진 SQSTM1과 결합을 통해서, KEAP1 단백질을 분해 시킴을 밝혔다. 그 결과로 증가된 NRF2의 활성이 간세포내 산화적 스트레스를 감소시켰다. 또한 ULK1이 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거할 수 있는 마이토파지 (Mitophagy) 를 활성화시킴으로써 손상된 미토콘드리아로부터 과다 생산되는 활성산소를 제거한다는 사실을 발견하였다. 이는 ULK1이 손상된 미토콘드리아의 제거 반응에 관여하는 PINK1단백질과 SQSTM1의 결합을 강화하여 가능했다. 이러한 ULK1의 두 가지 역할을 통해서 비알코올성 지방간염 형성 과정에서 생기게 되는 산화적 간 손상을 억제할 수 있음을 분자적 조절 기전과 함께 규명하였다. 본 연구 2부에서, 비알코올성 지방간염에 특이적으로 증가되어 있어 병리학적인 진단 마커로 알려진 SQSTM1이 비알코올성 지방간염을 완화시킬 수 있는 작용 기전에 대해 규명하였다. 이는 SQSTM1이 AMPK-ULK1의 결합을 더 강화 시킴으로써, ULK1의 인산화를 증가시켜서 오토파지를 활성화를 가능하게 했다. 결과적으로 오토파지를 통한 KEAP1 분해와 NRF2 활성을 증가시켜서 비알코올성 지방간염 발생과정에서 축적되어 있는 활성산소를 제거시키는 것에 대한 구체적인 분자적 조절 기전을 규명하였다. 또한, 오토파지의 관여를 판단할 수 있는 녹색 형광 (GFP) 마우스, SQSTM1 유전자 결핍 마우스와, 간 특이적으로 SQSTM1 유전자가 결핍된 마우스를 이용한 다양한 동물실험을 통해 타당성을 함께 제시하였다. 본 연구 3부에서, 소포체 스트레스 상황에서 미접힘단백질 반응 (Unfolded Protein Response, UPR)의 센서로 알려진 PERK가 ULK1-SQSTM1 axis를 직접적으로 조절하여 KEAP1-NRF2 pathway를 활성화시킴으로써 산화적 스트레스에 의한 간세포사멸로부터 세포를 보호할 수 있음을 규명하였다. 이에 대한 분자적 기전으로, PERK가 인산화효소로써 직접적으로 SQSTM1을 인산화할 뿐 아니라, SQSTM1과 AMPK의 결합을 강화하여 간접적으로도 SQSTM1을 인산화 시키는 것을 밝혔다. 게다가, PERK가 ULK1의 인산화를 직간접적으로 증가시켜서 이를 통해 오토파지를 활성화 시킬 수 있음을 규명하였다. 위의 결과들을 통해 밝힌 PERK-ULK1-SQSTM1 axis에 의해 매개되는 KEAP1-NRF2 pathway가 실제 비알코올성 지방간 질환 환자의 간에서도 활성화되어 있음을 관찰하였다. 이는 제시한 위 기전이 비알코올성 지방간염에서 발생하는 지방 독성에 의한 간세포사멸을 완화 시킬 수 있는 기전으로서 임상적으로도 중요하게 작용하고 있음을 보여준다. 종합적으로 ULK1 (본 연구 1), SQSTM1 (본 연구 2), 그리고 PERK (본 연구 3) 단백질이 비알코올성 지방간염 치료를 위한 효과적인 표적 단백질이 될 수 있다는 것을 밝혔다.