Gene corrections for two types of disease-related single nucleotide polymorphisms in patient-derived cells via CRISPR/Cas9 system

Abstract

Target-specific gene modification using engineered nucleases such as zinc finger nuclease (ZFN), transcription activator-like effector nuclease (TALEN), and type II clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRIPSR-associated protein 9 (Cas9), is a promising strategy to correct various human genetic disorders. Among these techniques, CRISPR/Cas9 can be applied most easily to the desired target site. The target specificity of CRISPR/Cas9 can be modified by simply replacing the guide RNA (gRNA), making it more suitable to deal with different types of mutations than other nucleases. Therefore, CRISPR/Cas9 has been researched as the most useful tool for treating mutations associated with human genetic diseases. There are more than 54,000 human genetic variants associated with disease, and 58% of human genetic diseases are caused by single nucleotide polymorphisms (SNPs). Among these diseases, mitochondrial DNA (mtDNA)-related diseases and coagulation factor VII (FVII) deficiency are known as most the common diseases caused by SNPs. This study performed genetic modifications for these two types of diseases using CRISPR/Cas9. First, for mitochondrial gene editing, a mitochondria-specific Cas9 (mitoCas9) was constructed, which successfully migrated to mitochondria. However, when plasmids were delivered that encode mitoCas9 and gRNA for mitochondrial genome editing into patient-derived cells, the gRNA did not translocate to mitochondria properly. Therefore, CRISPR/Cas9 did not work as expected in mitochondria. On the other hand, when mitoCas9 and gRNA are delivered as a ribonucleoprotein (RNP) complex, which directly injects mitoCas9 and gRNA into the cytosol, some of the mutant mtDNA in patient-derived heteroplasmic cells could be removed. Thus the total amount of mtDNA could be downregulated by the mitoCas9/gRNA RNP complex. Although these changes were insufficient to enable functional recovery due to a low translocation efficiency and a short half-life of the RNP complex, these results suggest that mitoCas9/gRNA RNP complexes can be a useful method for mitochondrial genome editing. Next, for gene correction of FVII deficiency-related SNPs, FVII-induced pluripotent stem cells (FVII-iPSCs) were generated from patient-derived fibroblasts, which contain novel compound heterozygous mutations in the blood coagulation factor FVII locus. By using the CRISPR/Cas9 system and single-stranded oligodeoxynucleotides (ssODNs) as the donor template, the two mutations were sequentially corrected. After differentiation of gene-corrected FVII-iPSCs to hepatocyte-like cells (HLCs), I confirmed that the FVII activity of the FVIIC-iPSC-derived HLCs was restored to a similar level as wild type cells. Based on these results, this was an efficient method for gene correction of various disease-related SNPs using a CRISPR/Cas9 system, and this technique could be a valuable tool for gene therapy and cell therapy of various SNP-related diseases.

유전자 가위인 zinc finger nuclease (ZFN), transcription activator-like effector nuclease (TALEN), 그리고 type II clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRIPSR-associated protein 9 (Cas9) 을 이용한 표적 특이적인 유전자 교정은 인간의 유전 질환을 치료할 수 있는 좋은 방법으로 여겨지고 있다. 이 중에서 CRISPR/Cas9 은 guide RNA (gRNA) 를 이용한 표적 특이성을 쉽게 변형할 수 있어 다양한 돌연변이에 대응하기 좋다. 인간의 질환과 관련되어 있는 여러 돌연변이 중에서 58% 가 single nucleotide polymorphisms (SNPs) 에 의해 유발된다. 특히 미토콘드리아 유전체 돌연변이 관련 질환과 FVII 응고인자 부족 혈액응고 장애의 경우 관련한 돌연변이 대부분이 SNPs 로 알려져 있다. 따라서 CRISPR/Cas9 을 활용하여 다양한 SNPs 에 의해 유발되는 질환을 치료할 수 있는 시스템을 마련할 필요가 있다. 본 연구에서는 미토콘드리아 유전체 교정을 위해 몇 가지 방법을 시도하였다. 미토콘드리아 유전체 교정의 경우, 유전자 교정에서 일반적으로 많이 사용하는 플라스미드 전달 방식으로 유전자 가위를 전달하였을 때 gRNA 가 제대로 미토콘드리아로 이동하지 못하고 이로 인해 CRISPR/Cas9 시스템이 제대로 작동하지 않음을 확인하였다. 이를 해결하기 위해 Cas9과 gRNA 를 직접 세포 내에 넣어 주는 ribonucleoprotein (RNP) 복합체 방식을 이용한 결과 일부 지표에서 미토콘드리아의 유전형이 호전되는 결과를 확인하였다. 하지만 RNP 복합체를 이용한 미토콘드리아 교정은 그 효율이 낮아 기능적 회복에 까지는 이르지 못하였다. 그러나 이러한 접근 방식을 통해 미토콘드리아 유전체 교정에 대한 가능성을 제시하였다는 점에서 의미가 있다. 다음으로 제7 혈액응고 인자 (FVII) 결핍증의 유전자 교정을 위해 제7 혈액응고인자에 이형 복합 돌연 변이를 가진 환자 유래 세포로부터 유도만능줄기세포를 제작하였다. 2개의 서로 다른 SNP을 CRISPR/Cas9 시스템과 single-stranded oligodeoxynucleotides (ssODNs) 을 이용하여 교정을 하였고, 비교적 짧은 시간 내에 스크리닝하는 방법으로 두개의 돌연변이를 효과적으로 순차 교정하여 정상 세포로 되돌릴 수 있었다. 교정된 세포를 hepatocyte-like cells (HLCs) 로 분화한 후 FVII 활성도가 정상 세포와 유사한 수준으로 회복된 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 CRISPR/Cas9 을 이용한 다양한 형태의 SNPs 교정에 대한 가능성을 제시하였다.