Modulation of host NLRC4 inflammasome signaling pathway by bacterial secretant

Abstract

인플라마좀 신호는 녹농균 또는 마우스 장티푸스균과 같은 병원성 세균에 대한 선천면역방어에 기여한다는 것이 알려져 있다. 감염과 관련된 대부분의 논문들 에서는 숙주세포가 식세포작용을 통해 세균을 포식 한 후 인플라마좀 활성화와 관련한 연구를 진행해왔지만 세균이 분비하는 분자에 의한 인플라마좀 활성에 대한 연구는 잘 알려져 있지 않다. 본 연구의 1 부에서는 쿼럼센싱과 인플라마좀 신호와 관련된 결과를 다룬다. 쿼럼센싱은 독성 인자를 암호화하는 쿼럼센싱 연관 유전자의 발현을 조절함으로써 세균의 독성을 향상시키는 세균 간의 소통과정을 의미한다. 쿼럼센싱이 녹농균의 독성에 중요한 역할을 한다고 알려져 있지만, 숙주 선천면역반응에 영향을 미치는 쿼럼센싱의 분자적 효과에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 따라서 녹농균이 세포외공간으로 분비하는 쿼럼센싱 의존적인 분자와 인플라마좀 신호와의 연관성을 규명하고자 하였다. 녹농균의 배양액을 마우스 골수 유래 대식세포에 처리하였을 때, 야생형 녹농균이 아닌 쿼럼센싱 수용기 결핍 녹농균으로부터 분비된 플라젤린이 NLRC4 인플라마좀을 매개로 한 카스파제-1 의 활성화와 인터루킨-1β의 분비를 유발하였다. 이러한 상황에서 야생형 녹농균의 분비물은 프로테아제를 통해 세포외공간으로 분비된 플라젤린을 분해함으로써 NLRC4 인플라마좀 활성화를 저해하였다. 뿐만 아니라 이 분비된 프로테아제는 인플라마좀 성분들을 분해함으로써 인플라마좀 매개 반응의 전파를 억제하였다. 또한 쿼럼센싱과 연관된 독성인자인 파이오시아닌과 쿼럼센싱 신호물질인 3-oxo-C12 호모세린락톤은 NLRC4- 뿐만 아니라 NLRP3 인플라마좀의 활성화와 조립을 직접적으로 억제하였다. 위의 결과들을 토대로 본 연구의 1 부에서는 농녹균이 쿼럼센싱 의존적인 메커니즘을 통해 숙주의 인플라마좀 매개 방어 시스템을 회피할 수 있다는 것을 제시한다. 본 연구의 2 부에서는 세균성 분비물의 일종인 외막소포체와 인플라마좀의 활성화와 관련한 결과를 다룬다. 외막소포체는 공생 또는 병원성 그람음성균에 의해 생성되고, 다양한 물질들을 운반하는 역할을 함으로써 세균 간의 물질을 전달 하거나 숙주세포와 상호작용을 한다고 알려져 있다. 그러나 외막소포체가 숙주의 인플라마좀 활성화에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 분자적 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다. 따라서 마우스 장티푸스균의 세균성 분비물에 존재하는 외막소포체가 숙주 인플라마좀 신호의 활성화를 유도할 수 있다는 증거를 제시하고자 하였다. 마우스 장티푸스균의 배양액을 마우스 골수 유래 대식세포에 처리하였을 때, 마우스 장티푸스균의 세균성 분비물에 의해 NLRC4 인플라마좀의 활성화를 촉진하였다. 또한 세균성 분비물에 존재하는 외막소포체에 의해 NLRC4 인플라마좀 매개 카스파제-1 의 활성화와 인터루킨-1β의 분비가 유도되는 것을 확인하였다. 이러한 외막소포체에 의한 인플라마좀의 활성화는 클라트린 매개 내포작용에 의해 일어난다는 것을 확인하였다. 플라젤린 결핍 마우스 장티푸스균으로부터 분리한 외막소포체를 이용하였을 때에는 NLRC4 의존적인 인플라마좀의 활성화가 일어나지 않는 것을 확인함으로써 마우스 장티푸스균의 외막소포체에서 플라젤린이 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 다른 그람 음성세균인 녹농균의 외막소포체에 의해서도 NLRC4 의존적인 인플라마좀의 활성화를 확인하였고, 플라젤린을 가지고 있지 않은 대장균의 외막소포체에 의해서는 NLRC4 비의존적인 인플라마좀의 활성화를 확인함으로써 외막소포체에 존재하는 플라젤린의 역할을 다시 확인하였다. 위 결과들을 토대로 본 연구의 2 부에서는 마우스 장티푸스균의 외막소포체가 물질 운반체로서 플라젤린을 숙주세포에 전달함으로써 NLRC4 인플라마좀의 활성화를 일으킬 수 있다는 것을 제시한다. Inflammasome signaling can contribute to host innate immune defense against bacterial pathogens such as Pseudomonas aeruginosa or Salmonella typhimurium. In most studies, the activation of inflammasome casused by bacterial infection has been studied in host cells after engulfing bacteria. However, the inflammasome activation by bacterial-secreted molecules is not well elucidated. In part 1, the results regarding quorum sensing (QS) and inflammasome signaling are described. Quorum sensing means bacterial communication that improves the toxicity of bacteria by promoting the expression of many QS-related genes, such as those related to toxic factors. Although quorum sensing plays an important role in the toxicity of P. aeruginosa, little is known about the molecular effects of QS that affect the host innate immune response. Here, I showed that P. aeruginosa restrains inflammasome signaling by releasing QS-dependent molecules in mouse bone marrow-derived macrophages (BMDMs). Secreted flagellin in bacterial secretant from QS-defective strain lasR/rhlR mutant, but not from wild type P. aeruginosa triggers robust activation of the NLRC4 inflammasome. In this situation, bacterial secretant from WT P. aeruginosa impairs activation of NLRC4 inflammasome by degrading extracellular flagellin via secreted proteases. Furthermore, secreted-proteases from WT P. aeruginosa also degrade inflammasome components in extracellular space to inhibit the propagation of inflammasome-mediated responses. Additionally, both QS-related virulence factor pyocyanin and QS autoinducer 3-oxo-C12 homoserine lactone directly inhibit activation and assembly of NLRC4 and NLRP3 inflammasome. Collectively, these results indicate that P. aeruginosa evades the host inflammasome defense system through QS-dependent mechanisms. In part 2, the results regarding the outer membrane vesicles (OMVs), one kind of the bacterial secretant, and activation of inflammasome signaling are described. OMVs are produced by commensal and pathogenic gram-negative bacteria. OMVs are known as a cargo carrier that allows bacterial cell to communicate with each other, but also it interacts with host cells. But the molecular mechanism of how OMVs affect the activation of host inflammasome is not fully elucidated. Here, I present evidences that OMVs in bacterial secretant from S. typhimurium, intracellular bacteria, can induce host inflammasome signaling in BMDMs. First, bacterial secretant from S. typhimurium promotes the activation of inflammasome, and this result is dependent on NLRC4. Furthermore, OMVs trigger NLRC4 inflammasome activation because of the presence of flagellin and type Ⅲ secretory system (T3SS) component prgJ protein on the surface of isolated OMVs. The activation of inflammasome signaling by OMVs was mediated by clathrin-dependent endocytosis. When OMVs from flagellin-deficient S. typhimurium were used, it was confirmed that flagellin played an important role in the OMVs of S. typhimurium by observing that activation of NLRC4-dependent inflammasome did not occur. In addition, OMVs from P. aeruginosa, flagellated bacteria, promoted NLRC4-mediated inflammasome activation, but not from non-flagellated E. coli strain. Taken together, these data suggest that the OMVs of S. typhimurium can cause activation of NLRC4 inflammasome by transporting flagellin to host cells as a cargo carrier.