Effect of pravastatin on glucose metabolism in HK-2 cells and mice

Abstract

Background: Recent reports have revealed that statins are associated with increased incidence of diabetes. Although several mechanisms have been proposed, the role of the kidney glucose metabolism under statin treatment is still unclear. Methods: HK-2 and HepG2 cells, cultured under high or normal cholesterol conditions, were treated with statins (pravastatin, rosuvastatin, atorvastatin, and fluvastatin). Both gene and protein expression of the enzymes involved in glucose metabolism (glucose 6 phosphatase [G6PC], phosphoenolpyruvate carboxykinase [PEPCK], pyruvate kinase [PKLR], phosphofructokinase [PFK]) were measured. C57BL/6 mice fed either a normal or a high-fat diet were treated with pravastatin and the above-mentioned enzymes were evaluated both the kidney and liver. Result: A lactate dehydrogenate assay revealed that atorvastatin and fluvastatin exhibited direct cytotoxicity towards HK-2 cells. In HK-2 cells treated with pravastatin under high-cholesterol condition, the protein expression of only PKLR decreased dose dependently 0.65 ± 0.03 and 0.41 ± 0.07 after treatment with 2 mM and 4 mM pravastatin, respectively). In contrast, the protein expression of PEPCK in HepG2 cells increased significantly, while that of PKLR, PFK-1, and G6PC remained unchanged. Gene expression of PKLR in the pravastatin-treated kidneys from high-fat diet-fed mice decreased to 66 ± 0.02 when compared with that of the control, and the overall protein expression level also markedly decreased. In the kidneys of normal-fat diet-fed mice, gene expression of PFK and PEPCK tended to increase, while that of PKLR and G6PC remained unchanged. In contrast, no changes were found in the liver for all four enzymes. The protein expression level of only PKLR decreased when treated with pravastatin, with no detectable changes in the expression of other proteins. PKLR activity in the kidney decreased to 50.1 ± 6.5 and 38.2 ±10.1 at 2 and 4 weeks of treatment, respectively. No change in enzyme activity was found in the liver. Blood glucose levels at 2 and 4 weeks of treatment increased by about 45 ± 9% and 10 ± 8%, respectively, when compared with those of the control. Conclusion: We found that pravastatin decreased PKLR activity in the kidney. This change may be associated with the diabetogenic effect of statins. Further studies should be considered to elucidate the precise mechanism by which statins affect PKLR activity in the kidney.

배경: 지질대사개선제인 statin 계열의 약들이 당뇨의 유병율을 높인다는 보고들이 늘고 있으며 그 기전에 대한 다양한 설명들이 나오고 있으나, statin계열의 약물 투여 시 나타나는 당대사의 변화에 대한 콩팥 내에서의 역할은 불분명한 실정이다. 방법: 고농도 콜레스테롤 환경에서 배양된 HK-2 세포와 HepG2세포를 statin계 약물들 (pravastatin, rosuvastatin, atorvastatin, fluvastatin)로 처치 후 당 대사과정에 관여하는 4개의 효소 (G6PC, PEPCK, PKLR, PFK)의 유전자 및 단백질 발현의 변화를 관찰하고 대조군과 비교하였다. 고지방식이요법을 시행한 C57BL/6 쥐를 pravastatin처치 후 실험 쥐의 간과 콩팥에서 위에서 언급한 4개의 효소의 유전자 및 단백질 발현의 변화를 관찰하고 대조군과 비교하였다. 결과: Lactic dehydrogenase assay결과 atorvastatin과 fluvastatin은 직접적인 세포독성을 HK-2 cell에 주는 것으로 나타났다. 고콜레스테롤 환경에서 pravastatin을 처치한 HK-2 cell에서 PKLR만이 pravastatin 용량에 비례하여 단백질발현이 감소되는 것으로 나타났다 (2mM의 pravastatin 처치 시, 0.65 ±0.03; 4mM의 pravastatin 처치 시, 0.41 ± 0.07). 이와 다르게 같은 조건의 HepG2 cell의 경우 PEPCK의 단백질 발현은 높아졌으며 PKLR, PFK-1, G6PC의 변화는 없었다. 고지방 식이요법의 쥐에 pravastatin처치 후 콩팥에서 PKLR유전자 발현의 변화가 대조군에 비해 의미 있게 감소함을 보여주었다 (66 ± 0.2). 단백질 발현의 경우도 pravastatin을 처치한 경우 대조군에 비해 PKLR이 의미 있게 감소함을 보여주었다. 정상 콜레스테롤 상태에서 배양한 HK-2 cell과 HepG2 cell에 pravastatin 처치 후 4개의 효소의 유전자 및 단백질 발현을 각각 관찰하여 대조군과 비교하였다. HK-2 cell에서 PKLR의 유전자 발현이 증가되었고 다른 효소들의 변화는 관찰 할 수 없었다. HepG2 cell에서 4가지 효소의 변화는 없었다. 단백질 발현의 경우 HK-2 cell에서 PKLR의 감소가 pravastatin의 노출시간에 비례하여 나타났으며 다른 효소들의 변화는 관찰 할 수 없었다. HepG2 cell에서 4가지 효소의 변화는 없었다. 정상식이요법을 시행한 쥐에 pravastatin처치 후 콩팥과 간에서의 4가지 효소의 유전자 및 단백질 발현을 관찰 하고 대조군과 비교하였다. 유전자 발현의 경우 콩팥에서 PFK와 PEPCK의 발현이 증가되었고 간에서의 변화는 없었다. 그러나 단백질 발현의 경우 콩팥에서는 PKLR만이 처치기간에 관계없이 감소하였고 다른 효소의 변화는 없었으며 간에서의 효소 변화는 관찰 할수 없었다. 이러한 PKLR유전자 및 단백질 발현이 실제적으로쥐의 생체 내에서 어떤 식으로 나타난 가를 알기 위해 PKLR의 activity assay를 시행하였고 그 결과 콩팥에서는 PKLR의 활성도가 기간이 길어질수록 대조군에 비해 감소함을 보였고 간에서의 변화는 없었다. 결론: 본 연구를 통하여 pravastatin이 쥐의 콩팥 내에서 PKLR의 활성도를 감소시키는 것을 관찰 하였고, 이 변화가 statin의 당뇨발생 효과를 설명할 수 있는 근거를 마련하였다.