Restoration of the FVIII expression by targeted gene insertion in the FVIII locus of the hemophilia A patient-derived iPSCs

Abstract

Target-specific genome editing, using engineered nucleases zinc finger nuclease (ZFN), transcription activator-like effector nuclease (TALEN), and type II clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9), is considered a promising approach to correct disease-causing mutations in various human diseases. In particular, hemophilia A can be considered an ideal target for gene modification via engineered nucleases because it is a monogenic disease caused by the mutation of coagulation factor VIII (FVIII), and a mild restoration of FVIII levels in plasma can prevent disease symptoms in patients with severe hemophilia A. In this study, we describe a universal genome correction strategy to restore FVIII expression in induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from patients with hemophilia A by the normal FVIII gene expression in patient’s FVIII locus. We used CRISPR/Cas9 mediated homology directed repair (HDR) system to insert the B-domain deleted from of FVIII gene with or without the human EF1α promoter. After gene targeting, we obtained the FVIII gene correctly inserted in iPSC lines at a high frequency and these lines retained pluripotency after knock-in and the neomycin resistance cassette removal. More importantly, we confirmed that endothelial cells from the gene-corrected iPSCs could generate functionally active FVIII protein from the inserted FVIII gene with EF1α promoter. This is the first demonstration that the FVIII locus is a suitable site for integration of normal FVIII gene and can restore FVIII expression by the EF1α promoter in endothelial cells differentiated from hemophilia A patient-derived gene-corrected iPSCs.

유전자가위인 ZFN, TALEN, 그리고 CRISPR/Cas9을 이용한 타겟 특이적 유전자 교정법은 인간의 유전질환을 치료할 수 있는 좋은 방법으로 여겨지고 있다. A형 혈우병은 응고인자 8번 (FVIII) 유전자의 돌연변이로 인해 일어나는 단일 유전자 질환으로 약간의 FVIII 단백질 양의 증가만으로도 중증 증세를 완화시킬 수 있는 특성이 있어, 유전자 교정 치료의 적절한 타겟 질환으로 볼 수 있다. 이 연구에서는 CRISPR/Cas9 유전자 가위를 이용하여, A형 혈우병 환자 유래 역분화 세포의 FVIII 유전자의 exon 1번에 B-domain이 제거된 FVIII cDNA를 cDNA 단독, 혹은 EF1α 프로모터와 함께 삽입하였다. 유전자 교정후, EF1α 프로모터와 FVIII cDNA를 동시에 삽입한 유전자 교정 역분화 줄기세포 유래 혈관세포에서 활성화 가능한 FVIII 단백질이 발현함을 확인할 수 있었다. 이 연구는 EF1α 프로모터에 의해 발현하는 정상 FVIII cDNA를 돌연변이가 있는 인간 FVIII 유전자 위치에 삽입하고, 이러한 시도에 의해 환자유래 역분화 줄기세포 유래 혈관세포에서 정상 FVIII를 발현할 수 있도록 할 수 있음을 보인 시도로써 그 의의가 있다고 볼 수 있다.