Epigenetic downregulation of miRNA-34a and miRNA-449a induce epithelial-mesenchymal transition and acquired resistance to ceritinib

Abstract

Treatment with ALK tyrosine kinase inhibitors often elicits profound initial antitumor responses in ALK fusion-positive patients with lung adenocarcinoma. However, patients invariably develop acquired resistance to ALK inhibitors. Although the recent functional genetic studies characterized the mechanism of resistance to ALK inhibition, epigenetic mechanism of acquired resistance is poorly understood. Here we report histone H3 lysine 27 acetylation (H3K27ac) and microRNAs involved in acquired resistance to ceritinib, a second generation ALK inhibitor. Epithelial-to-mesenchymal transition with AXL activation was found in multiple in vitro and in vivo ALK-rearranged lung cancer models with acquired resistance to ceritinib. Genome-wide analysis identified that miR-34a and miR-449a are decreased with loss of H3K27ac and AXL and mesenchymal genes are increased in the process of acquired resistance. Pharmacological inhibition of AXL or ectopic expression of miR-34a or miR-449a restored sensitivity to ceritinib in resistant cells. We also found histone deacetylase inhibitor, panobinostat, synergistically induced anti-proliferative effects with ceritinib in resistant cells. Our findings demonstrate that H3K27ac remodeling is a crucial event in ceritinib resistance and inhibition of both ALK and HDAC could prevent or overcome acquired resistance to ALK inhibitors in individuals with ALK-rearranged lung cancer.

EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자에서 ALK 타이로신 키나아제 억제제 치료 시 초기에는 우수한 반응을 보이나, 결국 약제 내성을 획득하게 된다. 비록 ALK 억제제에 대한 획득 내성 연구들이 진행된 바 있지만, 현재까지 후성유전학적 기전에 대한 연구는 전무하다. 본 연구에서는 세리티닙이라는 2세대 ALK 억제제에 대한 획득 기전 규명을 위해 RNA-seq, MBD-seq, ChIP-seq 통합 분석을 통해 내성 획득 세포의 전사체, DNA 메틸화, 히스톤 아세틸화 등 후성 유전체 통합 분석을 실행하였다. ALK 양성 내성 세포주에서 모세포주에 비해 H3K27ac 부위에 탈 아세틸화가 두드러지게 나타나는 것을 확인하였고, AXL 발현 증가와 상피-간엽전환 (epithelial-to-mesenchymal transition)이 발생하는 것을 확인하였다. H3K27 아세틸화 감소와 함께 mRNA 발현이 감소하는 유전자들을 선별한 결과, miR-34a와 miR-449a의 H3K27 탈아세틸화로 인하여 miR-34a와 miR-449a의 발현이 감소하고, 이에 따라 이들이 하위로 조절하는 AXL 과 mesenchymal 유전자들의 발현이 증가하는 기전을 규명하였다. 또한 AXL을 억제하거나 miR-34a 와 miR-449a를 외부에서 주입시켜 주었을 때 세리티닙에 대해 다시 민감성을 획득하였다. 히스톤 탈 아세틸화 효소 억제제인 Panobinostat 에 의한 miR-34a 와 miR-449a의 탈 아세틸화 및 발현 조절이 가능한지 확인하기 위해 Panobinostat 처리 후 q-PCR, RNA-seq, ChIP-seq 분석을 수행하였고, Panobinostat 이 내성 세포주의 H3K27ac 부위에서 아세틸화를 증가시키는 것을 볼 수 있었다. Panobinostat을 세리티닙과 함께 내성세포주에 처리하였을 경우 병용효과를 확인할 수 있었고, G1 arrest 유도 단백질로 알려진 CDK inhibitor protein(CIP/KIP family)인 p21의 발현과, 세포사멸 (Apoptosis) 관련 단백질인 cleaved PARP와 cleaved caspase 3의 발현을 증가시킨 것을 확인하였다. 또한 miR-34a 및 miR-449 가 표적으로 하는 AXL 및 MET 등의 단백질 및 N-cadherin의 발현은 감소시켰고, 감소된 E-cadherin의 발현을 다시 증가시켰다. 상기 결과들을 통해 H3K27ac 리모델링으로 인한 miR-34a와 miR-449a 발현 감소가 세리티닙의 획득 내성에 중요한 역할을 하며, 이를 극복하기 위한 새로운 치료 방법으로서 히스톤 탈 아세틸화 효소 억제제와 세리티닙의 병용 요법에 대한 전략을 제시해준다.