Klotho provides a protective role against podocyte injury via cell cycle-dependent manner under diabetic conditions

Abstract

Background: Most studies on the protective effect of klotho against renal injury have been focused on tubulopathy instead of glomerular cells. The aim of this study was to test whether klotho can exert a protective effect against podocyte injury in an experimental model of diabetic nephropathy. Methods: In vitro, mouse podocytes were cultured in a medium containing 5.6 mM glucose (NG) or a high (30 mM) glucose concentration (HG) with or without 200 pM recombinant klotho (rKL). Additionally, a knockdown of klotho was performed using a small interfering RNA to examine the effect of endogenous klotho. In vivo, 32 mice were injected with either a diluent (n = 16, control) or with streptozotocin intraperitoneally (n = 16, diabetes; DM) to induce diabetes. Eight mice from each control and DM group were treated daily with rKL at 10 μg/kg/day. All the mice were euthanized 4 weeks after the development of diabetes. Results: Protein klotho was expressed in podocytes depending on PPAR-γ. HG treatment increased the expression of cell cycle-related proteins and apoptotic markers, but these changes were significantly attenuated by rKL. Nonetheless, the small interfering RNA against the klotho gene in HG-treated podocytes failed to enhance cell cycle arrest and apoptosis. In line with in vitro findings, protein expression of cell cycle-related proteins and apoptotic markers was increased in DM mice compared to control mice, and these increased expression levels were significantly decreased by rKL. Moreover, hypertrophy of glomeruli in DM mice was significantly alleviated after rKL administration. Conclusion: This study showed that klotho is expressed in glomerular podocytes, and its expression is regulated by PPAR-γ. Moreover, administration of klotho can attenuate glomerular hypertrophy via a cell cycle-dependent mechanism and thus decreases apoptosis. These findings provide new insights into the mechanisms of protective effects of klotho in diabetic nephropathy.

배경: 최근까지 여러 연구들은, 당뇨병성 신병증을 포함한 기타 실험적 신장병 모델을 통해 klotho의 신장병 진행에 대한 보호 효과를 보여주고 있지만, 대부분의 연구가 세뇨관에 국한되어 있다. 한편, 당뇨병성 신병증은, 사구체 병변이 주된 병리 변화이기 때문에, 당뇨병성 신병증 모델에서 klotho의 역할을 보고자 할 때, 사구체 및 사구체 세포를 이용한 실험은 의미가 있을 것이다. 방법: 생체 외 실험으로 족세포를 이용해 고포도당 (30 mM) 자극 후, klotho의 변화를 확인하고자 하였고, 재조합 klotho 투여 후 세포주기 관련 단백질 발현의 변화를 알아 보고자 하였다. 또한, 족세포로부터 발현된 klotho의 효과를 밝히고자, klotho knockdown을 시행하였다. 생체 내 실험으로 32 마리의 C57BL/6 생쥐를 이용하여, 16 마리에게 당뇨 유발을 위해 streptozotocin를 복강으로 투여하였으며, 이 중 8 마리에게는 osmotic minipump를 이용해 재조합 klotho (10 ug/kg per day)를 투여하였다. 반면, 대조군 16 마리 중에서 8 마리에게는 osmotic minipump를 통해 생리식염수를 투여하였다. 모든 군에서 한쪽 신장 제거술을 시행하여 좀더 빠른 신장 악화를 유발하고자 하였으며, 당뇨 유발 4주 후 희생을 통해 신장을 적출하여 단백질, RNA의 변화를 확인하였고, 면역형광법 및 면역조직화학을 시행하였다. 결과: 족세포와 혈관사이세포에서 klotho mRNA 및 단백질이 발현됨을 확인하였고, 고포도당 자극 후 수치가 감소함을 확인하였다. 더 나아가, klotho가 PPAR-γ 변화에 따라 발현됨을 알았다. 족세포에서 고포도당 자극으로 증가되었던 세포주기 관련 단백질인 p21, p27, p-p53과 세포사멸 관련 단백질인 Bax/Bcl2 및 cleavage caspase-3가 재조합 klotho 투여 후 유의하게 감소됨을 확인 할 수 있었으나, klotho 발현을 억제하였음에도 고포도당 자극 후, 이들의 발현 정도는 klotho 발현을 억제하지 않은 세포와 비교 시, 더 악화되지 않았다. 생체 외 실험 결과와 유사하게, 당뇨 유발 동물 모델에서 세포 주기 및 세포 사멸과 관련된 상기 단백질 발현이 정상군에 비해 유의하게 증가된 반면, 재조합 klotho 투여군에서는 투여하지 않은 당뇨 유발 군에 비해 이 단백질 발현들이 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다. 또한, 당뇨군에서 사구체 부피도 재조합 klotho 투여 후, 투여하지 않은 군에 비해 감소함을 확인하였다. 결론: 이상의 결과를 종합하여 볼 때, klotho는 사구체 족세포에서 발현되며, PPAR-γ에 의해 조절됨을 확인하였다. 실험으로 유도된 당뇨 모델에서 재조합 klotho의 투여로 세포 주기 관련 기전 및 사구체의 비대가 완화됨을 확인하였으며, 이는 세포 사멸과 관련되어 있음을 확인하였다. 이상으로 klotho는 당뇨병성 신장 질환 악화에 보호 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.