Structure and function analysis of melanocortin analogue with special reference to melanocortin receptor subtype

Abstract

[한글]멜라노코틴 유도체의 구조 및 기능에 관한 연구

멜라노코틴(melanocortin)은 색소침착, 부신피질 스테로이드 생합성, 기억, 혈압 및 체중 등의 조절에 관여하는 것으로 알려졌으며, 다섯 가지 멜라노코틴 수용체의 클로닝(cloning)은 멜라노코틴의 작용 기전을 연구 하는데 새로운 장을 열어주었다. MC3R 및 MC4R 효현제(agonist)는 현재 개발되고 있는 가장 중요한 비만치료제 후보물질중의 하나다. 그러나 특정 멜라노코틴 수용체 아형, 특히 MC3R 와 MC4R에 대한 활성도가 크고 선택성(selectivity)이 높은 효현제는 아직 개발 되지 못하였다. 이에 연구자 등은 특정 멜라노코틴 수용체 아형에 대한 높은 역가(potency)와 선택성을 가진 유도체를 탐색하고, 멜라노코틴 및 그 수용체간의 상호작용의 특징을 보다 구체적으로 조사하고, 또 비만치 료제로 쓰일 수 있는 후보 물질을 탐색하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 먼저 hMC1R, rMC3R 및hMC4R cDNA를 CHO 세포에 영구적으로 도입(stable transfection) 시켜서 각 멜라노코틴 수용체 아형을 과 표현하는 세포주를 만들었다. 여러 가지 멜라노코틴 유도체를 합성한 후 각 멜라노코틴 수용체 아형에 대한 활성도를 radioligand-binding assay 및 cAMP-generating assay 방법으로 측정하였으며, 유도체들의 구조 및 유도체-수용체간의 결합 및 활성화 기전을 규명하기 위해서 NMR 과 homology modeling방법을 도입 분석하였다. MC3R 및 MC4R에서 a-MSH-ND는 [Nle4]a-MSH에 비해 높은 활성도를 보였다. NMR 분석결과 a-MSH-ND는 Type I b-turn 구조를 보인 반면에 [Nle4]a-MSH는 헤어핀 루프(hairpin loop) 구조를 보였다. a-MSH-ND의 6번째 His을 다른 아미노산들로 치환할 때 [Arg6]a-MSH-ND를 제외하고는 세 가지 멜라노코틴 수용체 아형 모두에서 활성도가 현저하게 감소되었다. 한편 NMR 구조연구에서는 [Gln6]a-MSH-ND는 Type I’ b-turn 구조를 [Lys6]a-MSH-ND 및 [Gln6]a-MSH-ND(6-10)는 g-turn 구조를 보였다. 흥미롭게도 [Gln6]a-MSH-ND의 활성도는 a-MSH-ND에 비해 MC3R 및 MC4R에 대하여 약간 떨어지는 반면에 MC1R에서10,000배 정도 감소되었다. Homology modeling 분석결과 유도체의 6번째 아미노산기가 His에서 Gln로 치환함으로 6번째 및7번째 아미노산기의 측쇄 방향(side chain orientation)이 a-MSH-ND의 것과 서로 반대 방향으로 위치하는 것을 관찰 하였다. 따라서 수용체 결합부위(binding pocket)에 대한 유도체의 결합양상이 바뀐 것이 세 수용체 모두에서 두 유도체 활성도의 현저한 차이를 나타나는 원인인 것으로 사료된다. [Gln6]a-MSH-ND의 7번째 아미노산기 D-Phe의 phenyl ring이 MC3R 및 MC4R의 TM3 부위의 Ser122 및 Ser127과 각각 결합하는 반면에 MC1R에서 유도체의 D-Phe과 결합하는 부위가 두개 큰 methyl group를 가지고 있는 Val122로 바뀌었다. 따라서 [Gln6]a-MSH-ND와 MC1R의 결합은 MC3R 및 MC4R에 결합하는 것보다 더 어려운 것으로 사료되었다. 한편 In vivo실험에서 MC3R 및 MC4R에 대한 활성도가 가장 높은 유도체인 a-MSH-ND를 정상 수컷 ICR 백서 복강내에 투여한 결과 연속 3시간동안의 식이섭취(food intake)가 현저하게 억제되는 것은 관찰 하였다. 결론적으로 멜라노코틴의 핵심 아미노산기(core residue)인 His6-(D-Phe)7-Arg8-Trp9의 His6 중심으로 한 type I b-turn 구조가 멜라노코틴 유도체의 활성도를 결정하는데 매우 중요한 것으로 사료되며 6번째 및 7번째 아미노산기의 측쇄 방향도 멜라노코틴의 활성도를 결정하는데 중요하다는 것을 알 수 있었다.

[영문]Structure and function analysis of melanocortin analogue with special reference to melanocortin receptor subtype

Melanocortins, including a-MSH have been implicated in a variety of physiologic functions, such as skin pigmentation, learning, memory, analgesic and anti-inflammatory effects, the regulation of blood pressure, immune modulation and food intake. The cloning of five melanocortin receptor subtypes provided the tools for the systemic study of the molecular mechanisms involved their physiologic effects. As melanocortin reveals many different effects through the distinct receptor subtype, a selective ligand for a given receptor subtype is required to reduce the undesirable effects of melanocortin, accordingly, the structure and function analysis of ligand-receptor interactions has become more important. To search for new melanocortin analogues with high potency and selectivity for a given melanocortin receptor subtype, understand the more detailed characteristics of ligand-receptor interaction, and if possible, to develop candidate compounds likely to be used as anti-obesity drugs, we synthesized a-MSH analogues and compared their biological activity, including binding and cAMP-generating activity in CHO cell lines over-expressing hMC1R, rMC3R or hMC4R, and investigated their NMR structures and their patterns of ligand-receptor interaction to each receptor subtype by homology modeling analysis. Compared to [Nle4]a-MSH, the linear MTII (melanotan II) designated as a-MSH-ND, in spite of deletion of several N- and C-terminal residues, exhibited better activity at both the MC3R and MC4R, while its IC50 and EC50 values were comparable to those of MTII reported previously. [Nle4]a-MSH showed a loop structure, while a-MSH-ND revealing a tight type I b-turn conformation. Substitution of the His6 residue of a-MSH-ND by Gln, Trp, Asn, Arg, Lys or Tyr, with the exception of [Arg6]a-MSH-ND, most of the a-MSH-ND analogues revealed lower activity than a-MSH-ND at all three receptors. Among the several analogues examined, [Gln6]a-MSH-ND had about 10,000 times less biological activity than a-MSH-ND at MC1R, whereas, the potencies of both oligopeptides were comparable at MC3R or MC4R. [Gln6]a-MSH-ND exhibited a type I’ b-turn that was very similar to the type I b-turn structure of a-MSH-ND, but a remarkable structural difference was observed at the side chain orientations of the 6th and 7th residues of [Gln6]a-MSH-ND, which were mirror images of those of a-MSH-ND. By homology modeling analysis, His6 of a-MSH-ND was found to interact with the TM2 regions of all three receptors (Glu94 of MC1R, Glu94 of MC3R, and Glu100 of MC4R), but [Gln6]a-MSH-ND did not. The phenyl ring of the D-Phe7 residue of [Gln6]a-MSH-ND revealed interaction with the TM3 regions of MC3R and MC4R (Ser122 of MC3R or Ser127 of MC4R). In MC1R, however, these serine residues corresponded to Val122, which contains two methyl groups that induce steric hindrance with D-Phe7 of [Gln6]a-MSH-ND. This might explain why the biological activity of [Gln6]a-MSH-ND at MC1R was significantly lower than that at MC3R or MC4R. In the in vivo experiments, it was found that intraperitoneal injection of a-MSH-ND (100nmole) gave rise to a significant inhibition of food intake for up to 3 hours (P<0.05 or P<0.01). These results suggest that a type I b-turn conformation comprising the residues of Asp5-His6-(D-Phe)7-Arg8 is important, especially, the side chain orientations of 6th and 7th residues is critical for determination of potency and selectivity of melanocortin analogues. MC1R-reluctance with the preservation of comparable MC3R and MC4R selectivity could be achieved by modifying the D-Phe7 orientation of a-MSH-ND, while keeping the ‘type I b-turn’-like structure. In addition, a-MSH-ND and its derivatives, especially those with high biological activity at MC3R and/or MC4R, could directly inhibit food intake.