Structural and functional comparisons of human glutamate dehydrogenase isozymes

Abstract

[한글]

사람조직에서 글루탐산 분해효소 (GDH)는 유전적 기원이 다른 두 가지 이상의 동위효소 (hGDH1, hGDH2)로 존재한다. hGDH1은 열에 비교적 안정하고, 몸 전체에서 발현되는 반면에 hGDH2는 열에 약하고 고환조직이나 신경조직에서 특이적으로 발현된다. GDH 동위효소의 구조와 기능에 대해서 알아보기 위하여, 1557-base-pair의 사람 GDH2를 유전자를 합성하여 대장균주를 이용해 활성을 지닌 효소로 발현하였다. 이것을 이용하여 사람 GDH 동위효소 간의 열의 안정성 차이에 관여하는 주된 아미노산을 동정하고자 하였다. 45C (pH 7.0)에서 열에 대한 효소의 불활성은 알로스테릭 조절제가 없을때 hGDH1 보다 hGDH2에서 더욱 빠르게 진행되었다. 하지만 hGDH1, hGDH2 모두 1 mM ADP 와 3mM L-Leu의 존재 시에는 열에 의한 효소의 불활성 속도가 느려졌다. 돌연변이를 일으키는 방법으로 hGDH2 유전자에서의 Ser443을 그에 대응하는 hGDH1 유전자의 Arg443으로 치환한 결과 hGDH2가 지니고 있는 열에 대한 불안정성이 사라졌다. 반면에 가능성이 있다고 보여지는 몇 가지 다른 아미노산에 대한 돌연변이들은 (L415M, A456G, H470R) 열의 안정성에 대한 특별한 변화를 보여주지 못했다. 따라서 사람 GDH 동위원소에서 Ser443 위치가 열 안정성에 중요한 역할을 하는 곳임을 알게 되었다.

다음으로 사람 GDH 동위효소의 글루탐산 결합부위를 알아보기 위하여 몇 가지 가능성이 있는 부위 (K94, G96, K118, K130, or D172)에 대해 돌연변이방법을 사용하였다. hGDH1과 hGDH2의 K94, G96, K118에서의 돌연체에서 효소활성이 크게 감소하였고 글루탐산에 대한 Km 값은4-10배정도 증가하였다. K130Y 돌연체에서는 글루탐산에 대한 Km 값이 1.6배정도에 불과한 반면 활성효율은 자연형의 2~3%를 보여주었다. 따라서 K130 위치는 글루탐산 결합보다는 효소활성에 있어서 중요한 곳임을 알게 되었다. 또한 D172Y 돌연체에서 알로스테릭 활성제인 ADP에 대한 활성의 감소가 확인되었다.

p-Chloromercuribenzoic acid는 사람 GDH의 활성을 감소시킨다. [14C]가 표지된 peptide를 확인한 결과 PCMB와 작용하는 곳은 C323이었다. hGDH 동위효소 자연체와는 다르게 Arg, Gly, Leu, Met 나 Tyr로 치환시킨 C323 돌연체들은 [14C]p-chloromercuribenzoic acid 와 결합하지 않았다. 이 돌연체들의 효소 활성 효율은 자연체의 11%~14%이었고 이러한 사실은 두 가지의 사람 GDH 동위효소에서 다르지 않았다. 알로스테릭 영향제인 ADP와 GTP는 [14C]p-chloromercuribenzoic acid과의 결합에 어떠한 영향도 끼치지 않았다. 지금까지의 결과는 C323 부위가 사람 GDH 동위효소의 효소활성에 관여한다는 것을 보여주고 있다.

알루미늄은 µM의 농도 범위에서 pseudo-first-order reaction에 의해 GDH를 불활성시킨다. 이러한 불활성은 pH에 의존하고 산성 상태에서 증가한다. 불활성된 GDH는 효소 단위 단량체 당 2몰의 알루미늄과 결합한다. 여러 흡착제들 중에서 구연산과 염화불소가 알루미늄과 효소의 복합체에서 알루미늄을 분리시킨다. 그 분리상수는 5.3 µM이다. ADP, NAD+나 GTP 결합부위에서의 실험은 그 부위가 GDH에 대한 알루미늄 비활성과 관련이 없다는 사실을 보여준다. 원편광 이색성 측정 실험에서 GDH에 대한 알루미늄의 결합은 효소의 α-나선구조 와 β-병풍구조를 감소시키고 랜덤코일구조를 증가시킨다는 사실을 확인하였다. 따라서 알루미늄에 의한 GDH의 불활성화는 알루미늄 결합에 의한 구조적인 변화에 기인한 것으로 생각할 수 있고 이러한 사실은 글루탐산 대사에 관여하는 효소에서 알루미늄에 의한 영향이 알루미늄에 의한 신경독성의 원인 중 하나일 것이라는 가능성을 제시해 준다.

마지막으로 GDH에 대한 siRNA를 만들 수 있는 벡터를 사용함으로써 파킨슨씨 병 같은 신경퇴행성 질환에서 GDH의 기능을 살펴보고자 하였다. siRNA는 무척추동물에서의 RNA 간섭 동안에 RNA 분해를 야기시키는 중간체로의 작용을 하는 19-21 뉴클레이티드의 이중나선 RNA이다. phGDH-siRNA3 과 phGDH-siRNA4의 co-transfection은 GDH 발현을 억제시키고 mRNA 양을 감소시킨다는 것을 확인하였다. 또한 TUNEL 검사를 통해서 이러한 GDH의 유전자 소멸이 신경세포에서 세포사를 일으킨다는 사실과 caspase 3 발현의 증가가 유도된다는 점을 확인하였다. 따라서 신경세포에서 사람 GDH의 억제는 세포사와 관련이 있다는 사실을 증명하였으며 이는 신경세포 내에서 GDH가 중요한 작용을 한다는 것을 제시해주고 있다.

[영문]Molecular biological studies confirmed that two human glutamate dehydrogenase isozymes (hGDH1 & hGDH2) of distinct genetic origin are expressed in human tissues. hGDH1 is heat stable and expressed widely, whereas hGDH2 is heat-labile and specific for neural and testicular tissues. To gain a insight into the structural and regulatory basis of GDH isozymes, a 1557-base-pair gene that encodes human GDH2 has been synthesized and expressed in E. coli as a soluble protein. At 45oC (pH 7.0), heat inactivation processed faster for hGDH2 (half-life = 45 min) than for hGDH1 (half-life = 310 min) in the absence of allosteric regulators. Both hGDH1 and hGDH2, however, showed much slower heat inactivation processes in the presence of 1 mM ADP or 3 mM L-Leu. In hGDH isozymes, the 443 site is Arg in hGDH1 and Ser in hGDH2, respectively. Substitution of Ser into Arg at 443 site by cassette mutagenesis abolished the heat-lability of hGDH2 with a similar half-life of hGDH1. These results suggest that the Ser 443 residue plays an important role in the different thermal stability of hGDH isozymes.

The cassette mutagenesis at several putative positions (K94, G96, K118, K130, or D172) was performed to examine the residues involved in the glutamate-binding of the hGDH isozymes (hGDH1 and hGDH2). There was dramatic reduction in the catalytic efficiency in mutant proteins at K94, G96, K118, or K130 site, but not at D172 site. The Km values for glutamate were 4~10-fold greater for the mutants at K94, G96, or K118 site than for the wild-type hGDH1 and hGDH2. The decreased catalytic efficiency of the K130 mutant mainly results from the reduced kcat value, suggesting a possibility that the K130Y residue may be involved in the catalysis rather than in the glutamate-binding. The reduction of ADP activation in D172Y mutant was more profoundly observed in hGDH2 than in hGDH1. It is suggested that K94, G96, and K118 residues play an important role, although at different degrees, in the binding of glutamate to hGDH isozymes.

Reaction of hGDH1 and hGDH2 with p-chloromercuribenzoic acid resulted in a loss of enzyme activity. A reactive cysteine residue was identified as C323 in the overall sequence of [14C]-labeled peptide. In contrast to the wild-type hGDH isozymes, no incorporation of [14C]p-chloromercuribenzoic acid was observed with the C323 mutants containing Arg, Gly, Leu, Met, or Tyr at position 323 using synthetic hGDH genes. The enzyme efficiency (kcat

Km) of the mutants showed only 11%~14% of the wild type hGDH isozymes, suggesting that the decreased efficiencies of the mutants mainly result from the decrease in kcat values. There were no differences between the two hGDH isozymes in sensitivities to the mutagenesis at C323 site. It is suggested that C323 plays an important role for the catalysis of hGDH isozymes.

Aluminum inactivated hGDH isozymes by a pseudo-first-order reaction at µM concentration. Double reciprocal plot gave a straight line with a kinact of 2.7 min-1 and indicated the presence of a binding step prior to inactivation. The inactivation was strictly pH-dependent and a marked increase in the sensitivity to aluminum was observed as the pH decreased. When preincubated with enzyme, several chelators such as N-(2-hydroxyethyl) ethylenediaminetriacetic acid, ethylenediaminetriacetic acid, citrate, or NaF efficiently protected the enzyme against the aluminum inactivation. In a related experiment, only citrate and NaF released the aluminum from the completely inactivated aluminum-enzyme complex and fully recovered the enzyme activity. The dissociation constant for the aluminum-enzyme complex was calculated to be 5.3 µM. Circular dichroism studies showed that the binding of aluminum to the enzyme induced a decrease in α-helix and β-sheet and an increase in random coil. Therefore, it is suggested that inactivation of hGDH by aluminum is due to the conformational change induced by aluminum binding. These results suggest a possibility that aluminum-induced alterations in enzymes of the glutamate system may be one of the causes of aluminum-induced neurotoxicity.

GDH function may be of importance for neurodegenerative disease such as Parkinson''s disease. In this study, several vector-based siRNA of hGDH was constructed and directly expressed intracellularly from a plasmid DNA. Using immunoblotting method, it was confirmed that hGDH expression were knockdown by most of phGDH-siRNAs in human neuroblastoma cells. RT-PCR analysis showed that mRNA level also decreased like as hGDH protein level. TUNEL assay after 48 h co-transfection revealed that inhibition of hGDH expression induced apoptotic condition and increased caspase-3 activity in human neuroblastoma cells. It is shown that inhibition of hGDH expression in neuronal cell are related with apoptosis.