Flow cytometry를 이용한 말초혈액 림프구내 이온화 칼슘의 역동학적 분석

Abstract

[영문]

[한글]

세포내 이온화 칼슘은 세포의 외부자극에 대하여 세포내로 신호를 전달하는 체계의 이

차전달자로서 중요한 역할을 담당하고 있다. Fura-2, indo-1, 그리고 fluo-3와 같은 칼슘

지시자의 개발 및 그 측정방법으로 flow cytometry(유세포분석기)의 발달로 무손상 세포

에서의 세포 활성화의 초기단계의 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 fura-2 및 indo-

1 칼슘지시자는 광원으로 자외선 레이저가 필요하여 실제사용상 많은 제약이 되어왔다.

가장 최근에 개발된 칼슘지시자인 fluo-3의 분광속성은 488nm의 argon 이온 레이저 및 fl

uorescein isothiocyanate 여과 대역폭을 갖춘 일반형의 유세포분석기의 사용에 적합하도

록 개발되었다. 따라서 본 연구에서는fluo-3를 칼슘지시자로 하여 유세포분석기를 이용하

여 optical constant calibration 법과 in situ calibration 법으로 휴지기의 말초혈액

림프구 세포내 이온화 칼슘을 정량화하여 그 측정방법의 검사능력을 평가하며 정상인의

전체 림프구 세포내 이온화 칼슘의 농도 및 T 림프구 세포내 이온화 칼슘농도를 각각 측

정하며 질환에 따른 세포내 이온화 칼슘농도를 관찰하여 임상적 유용 가능성을 알아 보고

자 하였다.

유세포분석기에 의한 이온화 칼슘측정법의 평가로 calibration 방법에 따른 정밀도, 최

소검출농도 및 분석범위, fluo-3의 안정성 등을 실험하였고 혈액암 세포를 이용하여 fluo

-3의 부하효율성을 알아 보았다. 임상적 유용성을 알기 위하여 정상대조군으로 54명, 질

환군으로 52명의 신장이식 수술 시행군과 20명의 당뇨환자군을 대상으로 세포내 이온화

칼슘농도를 측정하였다. Fluo-3 칼슘지시자의 부하시 형광강도는 pluronic F-127을 4.8×

10**-6 M, 기기 예민도의 척도인 변이계수는 SNARF-1 AM 0.27M을 동시부하한 경우 대조군

에 비하여 향상된 결과를 얻었으며 fluo-3의 부하시 안정성은 최대 5시간까지 였다. Opti

cal constant calibration 법을 위한 칼슘운반체 4-bromo-A23187의 최적농도는 5μM이었

고 fluo-3 칼슘지시자의 해리상수는 470nM이었다. In situ calibration법에 의한 유세포

분석기의 최소검출농도는 4.34nM이었으며 전체 림프구나 T 림프구 세포내 이온화 칼슘 농

도는 각각 116.69±16.77nM, 112.80±16.39nM로 유의한 차이가 없었다. 일내 검사 변이계

수는 in situ calibration 법 및 optical constant calibration 법에서 각각 6.67%, 13.8

6%이었고 개인내 검사 변이계수는 13.99%, 16.12%로 in situ calibratoin 법의 재현성이

우수하였고 혈액암 세포에서 fluo-3의 부하율이 감소하는 경우가 있었는데 이는 20μM의

verapamil을 동시에 부하시킨 경우 정상대조군의 형광변화비 0.95초0.15보다 높은 3.63초

3.90의 형광변화비가 관찰되었다. 정상대조군의 참고범위는 73.54∼155.09nM이었으며 성

별에 따른 차이는 없었고 cyclosporine을 복용중인 신장이식 환자군은 정상대조군의 세포

내 이온화 칼슘농도에 비해 37% 낮게 유지되고 있었으며 급성거부반응을 보인 환자군에서

세포내 이온화 칼슘 농도는 276% 중가된 소견을 보였다. 한편, 당뇨환자군에서도 정상대

조군에 비해 세포내 이온화 칼슘농도는 159% 증가되어 있었으며 이는 혈중 당농도와 유의

한 상관성이 있었다(r=0.896).

이상의 결과로 휴지기의 말초혈액 림프구 세포내 이온화 칼슘의 정량은 in situ calibr

ation 법에 의한 것이 검사결과의 표준화에 적합할 것으로 생각되었으며 신장 이식 수술

이후에 세포내 이온화 칼슘 정량은 급성 거부반응에 관한 추적관찰 검사로 또 다약제 내

성을 보이는 혈액암 환자군에서는 신속한 진단방범으로서의 임상적 유용성이 기대되며,

향후 유세포분석기의 장점인 다색상 염색을 통한 동시분석을 이용하여 다양한 세포집단에

서 보고자 하는 세포아집단만을 대상으로 여러가지 척도를 단세포에서 측정하는 것이 보

다 정확한 결과의 도출에 유리할 것으로 생각되었다.

Kinetie analysis of intracellular ionized calcium level from human Peripheral blood

lymphocytes using flow cytometry

Jung Woon Lee

Department of Medicine The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Professor Oh Hun Kwon)

Intracellular ionized calcium plays a central role in the transduction of

external stimuli as a critical second messenger. With the introduction of

calcium-sensitive fluorochromes such as fura-2, indo-1, and fluo-3, and the

development of technology for flow cytometry, measurement of intracellular calcium

has become a fascinating new tool for studying the early events of cell activation

in intact cells. However, the first cytosolic calcium indicators, such as fura-2

and indo-l, were not excitable by visible light, and the requirement for a UV laser

posed a considerable limitation in most laboratories. The spectral properties of

fluo-3, which is the newest of these Ca**2+ dyes, allows the analysis of

intracellular ionized calcium level by most flow cytometers that are equipped with

the usual 488 nm-line, argon-ion laser excitation source and fluorescein (FITC)

filter bandwidth. The aim of this study is to assess the performance of flow

cytometer for the measurement of intracellular ionized calcium level using calcium

Probe, fluo-3 with the different calibration procedures called optical constant

method and in situ calibration method, and to define the reference interval of

intracellular ionized calcium level of total lymphocytes and T-lymphocytes from

healthy people, and to find out the clinical implications through analyzing

distribution of intracellular ionized calcium level according to disorders.

For the analytical performance of flow cytometer on determining the concentration

of intracellular ionized calcium, precision study such as within-run and among-day

intraindividual measurements, lowest limit of detection, analytical range, and the

loading stability of fluo-3 were done. And the study for loading efficacy of fluo-3

in abnormal cells using leukemic cells was also performed. Fifty four cases of

healthy people, 52 cases of renal transplants, and 20 cases of diabetes mellitus

Patients were included in this study.

Fluorescent intensity of fluo-3 was increased when small amount of pluronic F-127

was added together with the fluo-3 unto final concentration 4.8×10**-6 M, and

coefficient of variation as a parameter of instrument's sensitivity was improved

with the simultaneous loading of 0.2 μM SNARF-1 AM, which is pH indicator. Loading

effect of fluo-3 at room temperature was stable upto 5 hours. Optimal concentration

of calcium ionophore, 4-bromo-A23187 was 5 uM when optical constant calibration was

used, and the dissociation constant for fluo-3 was 470 nM. Lowest limit of

detection of ionized calcium concentration was 4.34 nM when in situ calibration

procedure was applied. The level of total ungated lymphocytes and the gated T

lymphocytes was 116.69± 16.77nM and 112.80± 16.39 nM, respectively and there was

no significant difference between the concentration of ionized calcium of total and

T lymphocytes. Within-run CV and among-day intraindividual CV were 6.67%, 13.99%

when in situ calibration procedure was performed and those values were 13.86% and

16.12%, respectively when optical constant calibration used. As the leukemic cells

were stained by the fluo-3, decreased loading efficacy was noted in 3 cases among 7

leukemic patients, and these findings were reversed by verapamil treatment. In this

study, the reference interval from healthy people was 73.54-155.09 nM and there was

no sexual difference on cytosolic free calcium level. The level of intracellular

ionized calcium was towered by 36.9%on renal transplant patients treated with

cyclosporine and prednisone than healthy control group. But, increased levels of

cytosolic free calcium were noted upto 276.0% on acute rejection group than control

group. And on the diabetes patient group, the level of intracellular ionized

calcium was increased by 159.1% than control group and correlated well with blood

glucose value(r=0.896).

These results indicated that in situ calibration method for intracellular ionized

calcium using flow cytometry with fluo-3 regarded as more accurate and standardized

method. And the quantitation of intracellular ionized calcium level might be used

as monitoring test for early detection of acute rejection after renal

transplantation and also expected as functional diagnostic test for detection of

cancer cells expressing multidrug resistant phenotype on their plasma membrane.

When multicolor analysis using flow cytometry will be used, more accurate results

and functional informations will be obtained together from single subset among

heterogenous cellular populations.