면역복합체성 가토 만성관절염에 관한 실험적 연구

Abstract

[영문]

[한글]

류마티스성 관절염은 1858년 Carrot경에 의해 처음 기술된 다발성 염증성 관절병변을

주로 나타내는 결체조직질환으로 알려져 있다.

류마티스성 관절염의 발생기전은 현재까지 정립된 정설은 없지만 널리 인정되어 있는

것은 유전적인 요인과 면역학적 기전에 의해 활액막 및 주위 조직에 염증성 병변이 지속

적으로 진행되는 질환으로 그 항원은 아직 확정되어 있지 않으나 유전적으로 감수성이 높

은 유전인자를 갖는 환자에서 비특이성 세균 감염과 관련이 있으리라는 추정과 주조직접

합계 (major histocompatibility system)의 인자가 체액성과 세포성 면역기전을 조절하는

데 관여한다는 보고도 있다. 또 류마티스성 관절염에서 C^^3 부산물을 추출하므로서 면역

복합체를 만성 관절염의 병인으로서 암시하는등 유전적인 요인과 면역학적 기전에 대하여

논의되고 있다. 고로 본 연구에서는 이러한 점을 참작하여 항원항체성 및 보체 활성 관

절염의 유발 가능성과 다핵백혈구와 거식세포의 관여여부 및 이에 따른 영향을 조사분석

하고 면역복합체 유발 관절염에서 조직손상기전을 검토하고저 BSA로 면역시킨 가토에 항

원을 관절강내에 주사하여 그 변화를 관찰하고 nitrogen mustard 계열의 면역억제제 및

항암제인 cyclophosphamide(cytoxan**(R) )와, anti-macrophage serum에 의한 제 변화를

비교 관찰하여 류마티스성 관절염의 유발 및 손상기전을 재검토하고저 본 연구에 착수하

였다.

실험동물은 체중 2.5kg내외의 가토 45마리를 다음과 같이 4군으로 구분하여 실험에 임

하였다.

제 Ⅰ 군 : 대조군

A : 비면역대조군 5마리

B : 면역대조군 5마리

제 Ⅱ 군 : 실험군

면역 후 관절염 유발군 15마리

제 Ⅲ 군 : cyclophosphamide처치군

면역 후 관절염 유발 및 cyclophosphamide투여군 15마리

제 Ⅳ 군 : anti-macrophage serum 처치군

면역 후 관절염 유발 및 anti-macrophage serum투여군 5마리

대조군(Ⅰ군)은 정상 가토 대조군을 A군 비면역대조군으로 하고, BSA로 전신감작을 하

여 면역시키기만한 면역대조군을 B군으로 하였다. 실험군(Ⅱ군)은 BSA로 전신감작을 하여

면역시킨후 3주후에 BSA를 슬관절 강내에 재주사하여 관절염을 유발하였다. Cyclophosph

amide 처치군(Ⅲ군)은 BSA로 면역시킨후 3주후에 BSA로 관절염을 유발하고, 동시에 cyclo

phosphamide를 정맥주사하였다. 항거식세포 혈청 처치군(Ⅳ군)은 BSA로 면역시킨후 3주후

에 BSA로 관절염을 유발하고, 동시에 항거식세포 혈청을 슬관절 강내에 국소적으로 주사

하였다.

면역은 bovine serum albumin(BSA)을 생리적 식염수에 용해시킨 후 BSA 10mg와 CFA(Com

plete Freund adjuvant, 1 mg/ml의 dried tuhercle bacilli가 들어있는 Difco Lab. 제품)

를 각 1ml씩 섞어 완전히 유화시켜 경부와 배부등 다수 부위에 피하주사하고 1주일 후에

같은 방법으로 추가 주사하였다. 관절염의 유발은 면역시킨 3주 후에 슬관절강내에 무균

적으로 BSA 5mg을 주사하였다.

Cyclophosphamide투여는 8mg/1kg씩 관절염 유발시킨뒤 6일간은 매일 정맥주사하였고 그

이후에 1주일에 2회씩 도살시까지 계속 정맥주사하였다.

거식세포 부유액은 Dyminski와 Argyris(1969)의 방법에 준하여 만들었고 항거식세포혈

청은 Marsman등(1970)의 방법에 준하여 만들고 우측 슬관절강내에 1회에 0.5ml씩 BSA 주

사와 동시에 주사하였고 1주 도살동물은 2회, 그리고 2주, 4주와 6주 도살동물은 3회씩

주사하였으며 항거식세포혈청의 주사는 3일 간격으로 하였다.

실험동물에 관절염을 유발하고 3일, 1주, 2주, 4주와 6주에 도살하여 검사하였다. 도살

시 혈청을 채취하여 latex test에 의하여 rheumatoid factor를 측정하였고 슬관절 활액막

의 변화를 보기 위하여 광학현미경, 전자현미경 및 면역형광현미경적 검색을 실시하였다.

면역성 관절염의 기전을 추구코자 가토에 bovine serum albumin(BSA)으로 면역시킨 후

슬관절강내에 항원을 재주사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. Bovine serum albumin으로 전신적 감작을 한 후 관절강내에 항원을 재주사하면 광학

현미경적으로 활액막세포의 증식 및 비후를 초래하고, 초기에는 중성구와 호산구의 침윤

을 그리고 후기에는 임파구와 형질세포의 침윤을 일으켜 인체의 류마티스성 관절염과 유

사한 면역복합체성 관절염을 일으킬 수 있었다.

2. BSA로 면역시킨후 관절염을 유발시킨 다음 cyclophosphamide의 투여는 이와같은 조

직반응을 현저히 억제하였으며 또한 항거식세포혈청의 관절강내 투여에 의해서도 염증반

응은 상당히 억제되었다.

3. 전자현미경적관찰에 의하면 활액막세포의 증식은 주로 M-형 활액막세포 증식에 의한

것이었으며, cyclophosphamide의 투여는 이 세포의 증식에 영향을 주지 못하였으나 항거

식세포혈청 투여는 활액막세포의 증식을 억제하였다.

4. 형광현미경적 관찰에 의하면 BSA, 면역글로브린, C^^3 및 섬유소등이 주로 활액막세

포 표재층에 침착되는 것이 관찰되었으며, cyclophosphamide의 투여는 이 침착을 감소시

켰고, 항거식세포혈청의 투여는 면역복합체, C^^3 및 섬유소의 침착을 현저히 억제하였다

.

이상과 같은 실험성적을 종합하여 보면 관절강내에서 항원-항체 반응을 일으켜 류마티

스성 관절염과 유사한 변화를 유발할 수 있었으며 cyclophosphamide의 전신처치는 염증반

응을 현저히 억제하였다. 이는 주로 백혈구 생성 억제에 의한 것으로 해석할 수 있으며,

일부는 cyclophosphamide의 면역 억제작용도 관여하는 것으로 사료되었다.

한편 항거식세포혈청의 슬관절강내 국소처치는 활액막세포 반응을 현저히 억제시켰으며

, 이는 가토복강내 거식세포가 관절강내 활액막세포 특히 M-형세포에 대한 직접적인 작용

에 의한 것으로 사료된다. 본 연구의 면역복합체성 관절염에 있어, 활액막의 조직손상은

다핵백혈구 및 보체활성에 의한 것뿐 아니라 거식세포도 관여되는 것으로 사료된다.

An Experimetal Study on the Immune Complex Induced Chronic Arthritis in Rabbits

Byeong Yeon Seong

Department of Medical Science The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Professors In Joon Choi, M.D. and Yoo Bock Lee, M.D.)

Rheumatoid arthritis was first described by Garrod in 1858 and is a connective

tissue disease showing migratory inflammatory arthropathy.

Compelling evidence implicates genetic and immunologic processes in the

initiation and perpetuation of the inflammatory events characteristic of rheumatoid

arthritis. The susceptibility to rheumatoid arthritis is an inherited trait and

determined by gene products of the major histocompatibility system. Such genes

probably control the humoral and cell-mediated immune mechanisms thought to

participate in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. However, the source and

character of the stimulus of the immunologic abnomalities are still not well known.

Dumonde and Glynn(1962) induced experimental arthritis by injection of homologous

and heterologous fibrin in immunized rabbits and by injection of egg albumin,

bovine serum albumin (BSA) and type Ⅱ collagen.

This study is aimed to evaluate the pathogenesis of rheumatoid arthritis by

induction of chronic arthritis with intraarticular injection of BSA in immunized

rabbits and to evaluate the effect of systemic administration of cyclophosphamide

and local admininistration of antimacrophage serum.

Material and Method.

A total of 45 rabbits, each weighing about 1.8∼2.5 kg, were used and divined

into 4 groups as follows :

Group Ⅰ : Control group

A. Non-immunized control 5 rabbits

B. Immunized control 5 rabbits

Group Ⅱ : Experimental arthritis group 15 rabbits

Group Ⅲ : Cyclophosphamide treated group 15 rabbits

Group Ⅳ : Anti-macrophage serum treated group 5 rabbits

Immunization : Bovine serum albumin dissolved in saline(BSA 10 mg/ml) was mixed

with equal parts of complete Freund adjuvant(Difco Laboratory, with 1 mg/ml of

dried tubercle bacilli) to produce a water-in-oil emulsion. The immunization was

conducted through intradermal injection of 2ml of this emulsion in 7 or 8 sites of

the neck, back and buttocks. A booster immunization was performed 1 week after the

first immunization.

Knee joint injection : The skin around both knee joints was shaved and cleaned

with 75% alcohol. With the knee partially flexed, the joint was entered either by a

medial approach into the suprapatellar pouch or through the patellar ligament, then

5 mg of BSA in 1.0ml of saline was injected into both knee joints. The interval

between immunization and intraarticular injection was 17 days.

Skin rest for the existence of delayed-type hypersensitivity : An intradermal

injection of 10 mg of BSA in 0.1 ml of saline was performed. The skin test was

regarded as positive if 24 hours after injection there was an easily palpable area

of induration at least 5 mm in diameter at the injection site. A positive skin test

was taken to indicate the existence of delayed-type hypersensitivity to BSA.

Macrophage suspension : The peritoneal macrophage suspension was made by method

of Dyminski and Argyris(1969).

Antimacrophage serum : The preparation of anti-macrophage serum was done by

method of Marsman et al. (1970).

Specimens taken from synovium were fixed in 10% formalin, embedded in paraffin,

and hematoxylin-eosin staining was done. Immunofluorescent studies from fresh

synoviums were conducted. For ultrastructural examination, tissues from the

synovium were fixed in 3% glutaraldehyde and 1% osmium tetraoxide with the ordinary

processing, and the examination was made using a Hitachi H-500 electron microscope.

Results and Summary :

1. Immune complex arthritis was experimentally induced by local injection of BSA

into both knee joints in rabbit following systemic immunization. The changes

resembled to rheumatoid arthritis in man and initiated with prominent proliferation

of synovial lining cells. Neutrophilic infiltration in the synovial tissue twas

present in the earlier stage but later lymphocytic and plasma cell infiltrations

were dominant.

2. The systemic administration of cyclophosphamide significantly inhibited the

inflammatory reaction of the immune complex induced arthritis, and the local

administration of anti-macrophage serum also reduced the inflammatory changes

markedly.

3. By electron microscopy, the proliferation of the M-type cells was prominent in

the synovial lining, which was not particularly influenced by the cyclophosphamide

administration, but was inhibited prominently by the anti-macrophage serum

administration.

4. By immunofluorescent microscopy, the deposits of BSA, immunoglobuline, C^^3

and fibrin were clearly demonstrated mainly in the synovial lining. These deposits

were somewhat reduced by the cyclophosphamide administration, but were greatly

inhibited by the anti-macrophage serum administration.

In summary, the reduction of inflammatory reaction by the cyclophosphamide

administration appears to he mainly by selective depletion of neutrophils, and

partly by immune suppression. It appears that the rabbit abdominal macrophage has

the common morphologic, functional and antigenic patterns with the M-type synovial

lining cells. There is another possibility that the cross-reacting antigens between

macrophage and the M-type cell of synovial lining may exists. It could be concluded

that in this experimental immune complex arthritis, the site of localization of

immune complexes seems to be the synovial, M-type cell, and the tissue injury of

synovium is largely mediated not only by neutrophils and complement, but also by

macrophages.