3'-Me DAB에 유도되는 간장암 세포막 특이 단백질 정제 및 이 물질이 포도당 투과에 미치는 영향

Abstract

[영문]

[한글]

정상 세포가 발암성 virus(Wu 등, 1969: Reutter와 Bauer 1978: Vischer와 Reutter 197

8)나 발암성 화학물질(Old와 Boyse 1964; Klein 1968; Law 1969: Baldwin 등, 1971)에 의

해 암세포로 변형되면 숙주세포 원형질막 표면에 새로운 단백질이 표현된다고 알려져 있

다. 그러나 이 새로운 단백질의 생물학적 기능에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 암세

포는 분열과 성장이 활발한데, 이 과정에서는 에너지원으로 glucose가 필요하고 세포내에

서는 anaerobic glycolysis의 증가(Warburg 1956), glycolysis의 조절기능 변화(Lo 등, 1

963)가 일어나고 Moloneysarcoma virus에 의해 유도된 mouse 암세포 원형질막에서 포도당

운반이 증가된다고 보고하였을 뿐(Hatanaka 1974) 그 이유에 대해서는 아직 모르고 있다

. Lim과 Kim(1979)은 백서 간장조직에서 분리한 간장 세포에 0.25㎎% trypsin을 함유한 H

anks' 용액을 40℃에서 5분간 처리하면 CO^^2 생산이 약 10% 증가한다고 보고하였다. 즉

trypsin 처리에 의한 세포막 단백질 변화가 포도당 투과 및 그 대사에 영향을 미친다는

사실을 시사하였다. 이에 본인은 백서에서 간장암을 유발시키는 3'-Me DAB을 0.06% 첨가

한 식이를 투여하여 간장암을 유발시키고 간장암원형질막 표면에 표현된 단백질을 부분

정제 분리하여 liposome의 이중막에 삽입시킨 후 이 종양 특이 표면 단백질이 D-glucose

(14)**C(U)의 운반에 관계하는 지를 구명하고 이 종양 특이 표면단백질 외에 간장암 세포

막 단백질(integral protein)이 포도당 투과에 관여하는 지를 확인하기 위해 세포의 원형

질막을 분리한 다음 2% deoxycholate로 막 단백질을 추출하여 liposome의 이중막에 삽입

시킨 후 정상 간장 세포의 막 단백질을 삽입시킨 liposome과 비교하고자 본 실험에 착수

하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 3'-Me DAB으로 유발한 간장암 세포 원형질막 표면에 나타나는 종양 특이 표면 단백

질을 3M KCI로 추출한 다음 Sephadex G-200 gel filtration chromatography법을 이용하여

종양특이 표면 단백질이 포함된 fraction 19∼26을 모아 DEAE-Sephadex A-50 이온교환 c

hromatography법을 통하여 얻은 fraction 49∼51에서 분자량 66,000에 해당하는 종양 특

이 표면 단백질을 부분 정제 분리하였다.

2. 단순(simple) liposome막을 통과한 D-glucose (14)^^C(U)의 양은 0∼240분까지 별

차이가 없고(48∼35 DPM), 종양 특이 세포막 표면 단백질을 삽입시킨 liposome막을 통과

하는 D-glucose (14)^^C(U)의 양은 0∼10분까지는 단순 liposome과 별 차이가 없었으며 (

31∼68 DPM) 20분부터 180분까지는 배양 시간에 비례하여 증가하고 그 이후부터 240분까

지 포화 현상을 보였다. 비특이적 (nonspecific) 포도당 운반 요인을 제거하기 위해 여기

에 과량의 cold glucose를 가한 후 운반된 양을 관찰한 결과 단순 liposome에서 통과된

양과 별 차이가 없었다. 이러한 결과는 종양특이 세포막 표면 단백질이 facilitated diff

usion기전에 의해 D-glucose (14)**C(U) 운반을 증가시키는 것으로 사료된다.

3. 정상 간장 세포 및 간장암 세포에서 분리한 원형질막의 표식효소인 5'-nucleotidase

활성은 정상 간장 세포 원형질막에서 11.23 2.24 μmoles/10 min/㎎ protein이었고, 간장

암 세포 원형질막에서는 3.25 0.55 μmoles/10 min/㎎ protein으로 정상 세포막에 비해

간장암 세포막에서 효소 활성이 약 1/3로 감소되었다. 이와 같이 분리한 간장 세포 원형

질막에 2% deoxycholate를 처리하여 막단백질을 추출하고 소정의 방법으로 liposome에 삽

입시켰다. 정상 간장 세포 원형질막에서 얻은 단백질을 삽입한 liposome에서 0∼240분까

지 운반된 D-glucose (14)**C(U)의 양은배양 시간에 따라 차이가 없었으나(170∼106 DPM)

간장암 세포 원형질막 단백질을 삽입한 경우 0∼40초까지는 대조군과 차이가 없었고(61

∼145 DPM) 1∼60분까지는 D-glucose(14)**C(U)의 이동되는 양은 배양 시간에 비례하여

증가하고 그 이후 240분까지 포화 현상을 나타냈다. 이때 이동된 radioactiTe glucose의

양은 간장암 세포막 표면 단백질에 의해 이동된 양의 약 10배 정도이었다.

이상 실험 결과로 미루어 정상 세포가 암세포로 변형되는 과정에서 세포막에 존재하는

막단백질이 변형되었거나 세포막 내에 이미 존재하는 D-glucose 이동에 관여하는 단백질

이 양적으로 증가하여 세포내 대사에 필요한 D-glucose를 보다 많이 이동시키는 것으로

사료되며 이러한 운반과정에 종양 특이 세포막 표면 단백질도 어느 정도 관여하는 것으로

생각된다.

A Study on the Glucose Transport Using Reconstituted Liposomes of Partially

Purified Tumor Specific Surface Proteins and Integral Proteins of Plasma Membrane

of 3'-Me DAB Induced Rat Hepatoma

Chun Sook Kim

Department of Medical Science The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Professor Yeen Soo Kim, M.D., Ph. D.)

Cancer cells that have transformed by oncogenic viruses(Wu et al, 1969; Reutter

and Bauer 1978; Vischer and Reutter 1978) or chemical carcinogens(old and Boyse

1964; Klein 1968; Law 1969; Baldwin et al, 1971) are known to express new Proteins

on their Plasma membrane surfaces. However, the biological roles of these proteins

are mysterious.

In an attempt to investigate the possible role of these surface proteins of

plasma membrane, tumor specific surface proteins were induced by 3'-Me DAB which is

known as a potent chemical carcinogen for rat liver. Partially purified surface

proteins of rat hepatoma plasma membranes and integral proteins of plasma membranes

from control and rat hepatoma cells were reconstituted into artificial biological

membrane, liposome and uptake of D-glucose (14)**C(U) into each liposome was

measured.

The results were summarized as fellows:

1. Tumor specific plasma membrane surface protein having molecular weight of

66,000 from 3'-Me DAB induced rat hepatoma was partially purified by 3M KCI

extraction, Sephadex G-200 gel filtration and DEAE-Sephadex A-50 ion exchange

chromatographic procedures.

2. D-glucose (14)**C(U) uptake in simple liposomes was unchanged (45∼35 DPM)

between 0∼240 minutes, whereas in liposomes reconstituted with surface proteins,

the uptake was increased linearly between 20∼ 180 minutes and showed saturation

phenomena thereafter.

In the presence of excess cold glucose, the uptake of D-glucose (14)**C(U) into

the reconstituted liposomes was not significantly different from that of simple

liposome. These results suggest that the tumor specific surface proteins of plasma

membrane of hepatoma are involved in the D-glucose transport.

3. The activity of 5'-nucleotidase, which is a marker enzyme of plasma membranes

was decreased to about 1/3 in hepatoma cell membrane(3.25 0.55 μmoles/10 min/㎎

protein) as compared to that of control cell membrane (11.23 2.24 μmoles/10 min/㎎

protein).

With these purified membrane preparations, integral proteins were extracted with

2% deoxycholate and reconstituted into liposomes. The D-glucose (14)**C(U) uptake

in control group was unchanged (170∼106 DPM) during the time between 0∼240

minutes. However, the uptake was increased from 1 minute to 60 minutes linearly and

showed saturation phenomena thereafter in 3'-Me DAB group.

The amounts of radioactivity in the liposome reconstituted with integral Proteins

extracted from purified preparations of plasma membrane of hepatoma were 10-fold

higher than those of tumor specific surface proteins.

In conclusion, during the transformation process of cells, the integral proteins

of plasma memtrane involved in D-glucose transport might Be chanced or increased in

amounts for the introduction of more sugars to supply for metabolic demands in the

transformed celly and in this process, tumor specific surface proteins presumably

participate in part