인체 상피세포의 시험관내 증식에 관한 연구

Abstract

[영문]

[한글]

광범위한 피부결손이 발생한 중화상 환자의 이상적인 치료는 빠른 시일내에 자가피부

이식술을 시행하여 주는 것이 바람직하며, 임상적으로 이러한 환자에서 사용 가능한 공여

부의 부족으로 피부이식술의 시행에 제한을 받게된다. 여러 저자들에 의해 다양한 체외배

양법을 사용하여 작은 피부 절편으로부터 넓은 상피세포층을 얻기 위한 많은 연구가 행하

여 졌지만, 아직까지 효과적이며 일관성있는 배양방법이 충분하게 알려지지 않았다.

본 연구는 111명의 정상인에서 유래한 113개의 피부편을 사용하여 시험관내 배양을 시

행하여 가장 효과적인 상피세포의 배양법을 연구하고, 배양세포의 성장특성을 관찰하였으

며, 또한 여러 생물학적 혹은 화학적제재를 배양액에 첨가하여, 이들이 배양 상피세포의

증식과 성장에 미치는 영향을 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 피부 미세절편을 0.25% trypsin-0.1% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)로 처

치한 배양에서 절편주변에 상피양 세포의 활발한 증식을 보였으나, 0.05% collagenase를

처치한 배양에서는 상피양 세포보다는 섬유아세포의 활발한 증식이 보였다. 효소를 처치

하지 않은 군에서는 세포의 증식을 거의 관찰할 수 없었다.

2. 배양세포의 성장 양상은 0.25% trypsin-0.1% EDTA로 처치한 배양 5일에 상피양 세포

의 활발한 증식을 보였으며, 배양 10∼14일에 더욱 증식되어 절편주위에 형성된 상피양

세포층을 관찰할 수 있었고, 이러한 상피양 세포층내에 산발적으로 불규칙적인 다세포층

이 이루어졌으며, 증식외곽부는 단층으로 이루어져 있었다. 배양용기 표면에 부착한 절편

의 위치가 서로 근접한 경우에는 절편에서 자라나온 상피양 세포가 융합하여 상호연결된

세포층을 형성하였다.

3. Keratin에 반응하는 특이항체를 이용한 면역효소 염색검사는 배양 증식된 상피양 세

포에서 양성반응을 보였으며, 이러한 양성반응은 대부분 다세포층의 상층에서 나타나 다

세포층이 층상화가이루어진 분화된 상피세포층임을 확인하였다.

4. Crude interleukin-6를 첨가한 배양에서 유의하게 높은 상피세포의 증식이 관찰되었

고,2-mercaptoethanol, cholera toxin, epidermal growth factor, recombinant interleuk

in-1, recombinant tumor necrosis factor는 유의한 영향을 미치지 못하거나 약간 억제하

는 경향을 나타냈다.

5. 피부조직편의 해부학적 부위에 따른 시험관내 상피세포의 증식은 대퇴부 피부와 표

피에서 채취했을 경우 증식이 증가된 경향을 보였고, 피부 전층보다 얇은 부분층 피부로

배양했을 때 증식이 의의있게 증가하였다.

이상의 결과로, 인체 상피세포의 시험관내 배양의 최적조건은 피부 미세절편을 0.25% t

rypsin-0.1% EDTA로 처치한 후 이들을 배양용기 표면에 근접하게 부착시켜 배양할 경우로

써, 이때에 세포증식으로 상호연결되어 면적이 확장된 상피세포층을 얻을 수가 있고, 특

히 crude interleukin-6의 사용으로 이와같은 인체 상피세포의 배양을 더욱 효과적으로

시행할 수 있으리라고 사료된다.

Study on the Growth Charaeteristics of In Vitro Cultured Human Epidermal Cells

Dong Chul Kim

Department of Medical Science The Graduate School, Yonsei Uniuenity

(Directed by Professor Young Ho Lee, M.D.)

Skin autograft is an ideal procedure to resurface burn wounds of patients with

extensive burns. However, since the availability of autogenous skin tissue is

practically limited in such patients, many attempts were made by researchers to

obtain expanded tissue or cell sheets from tiny skin fragments using various in

vitro culture techniques. Nevertheless, the effective means for such cultures have

not been fully established.

The present study was undertaken to investigate the most effective procedures for

in vitro cultivation of human epidermal cells using 113 skin fragments from 111

normal subjects. Growth characteristics of cultured cells as well as the effects of

various biological and chemical agents on their growth were evaluated.

The results were summarized as folluws:

1. Treatment of minced skin fragments with 0.25% trypsin-0.1%

ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA) resulted in an active proliferation of

epithelioid cells around the fragments, whereas similar treatment with 0.05%

collagenase showed an overgrowth of fibroblasts. In control cultures of the

fragments not treated with enzymes, little growth of cells was observed.

2. In culture of skin fragments treated with 0.25% trypsin-0.1% EDTA, the

outgrowth of epidermal cells from the edges of explants was observed at 5 days of

culture, and thereafter rapidly multiplied and formed an extended cell layer which

showed sporadic multilayered cell colonies at 10-14 days. In cases where the

culture explants were attached closely, cells located in the periphery of the

outgrown monolayers from each fragment formed bridges and ultimately the cell

monolayers were fused together to form doubly expanded cell layers.

3. Detections of keratin in cultured cells, using an immunoperoxidase assay, have

revealed that cells showing a typical pink-brown color as a positive reaction were

located mostly in the upper portion of mutilayered cell colonies.

4. Crude interleukin-6 added in culture media significantly increased the

proliferation of epidermal cells, whereas 2-mercaptoethanol, cholera toxin,

epidermal growth factor, recombinant interleukin-1, and recombinant tumor necrosis

factor had little or no effects.

5. Skin fragments from thigh or foreskin with thin split thickness showed

relatively increased proliferations of epidermal cells.

From these results, it can be concluded that the optimal in vitro culture

condition to obtain expanded human epidermal cells was the seeding of the minced

skin fragments closely following treatment with 0.25% trypsin-0.1% EDTA. This could

be achieved more effectively by the addition of crude interleukin-6 in the culture

medium.