심근세포에서 저산소 자극에 의한 heat shock protein 70의 발현 및 세포 보호 기전

Abstract

[한글]

저산소증은 세포의 생존에 영향을 주는 중요한 인자이며, 특히 심장에서 허혈성 심근병증, 심부전을 초래하는 세포사에 결정적인 원인으로 작용한다고 알려져 있다. 심근 세포에서 저산소증은 세포내 대사율의 저하, 세포 종창, ATP 고갈을 일으키며, 세포 내 단백질과 효소의 발현 및 활성을 저하시킨다. 한편 세포는 저산소증을 비롯한 다양한 스트레스들에 대해 스스로 방어 기능을 가지고 있다. 고온, 허혈, 방사선 등의 스트레스에 대해서 세포 내부에서는 그 강도에 따라 다른 반응을 보이지만 공통적으로 heat shock protein (Hsp)의 발현이 유도된다는 특징이 있다. 특히 Hsp70은 허혈 및 저산소증에 대한 심근 세포의 저항성을 항진 시켜서 심근 세포를 보호하는 것으로 보고되고 있다. 하지만 아직까지 저산소증에 의한 Hsp70의 발현 양상 및 세포 보호 효과를 일으키는 구체적인 기전에 대한 연구가 미미하고, Hsp70의 발현을 유지시키거나 증가시킬 수 있는 약물에 대한 연구가 부족한 상태이다. 따라서 본 연구의 목적은 저산소 상태에 있는 심근 세포에서 Hsp70의 발현 양상을 관찰한 후, Hsp70의 발현을 유도할 수 있는 물질을 찾아내고 세포 보호 효과를 일으키는 기전을 알아보고자 하였다.

백서의 심근 세포를 배양하여 24 시간동안 저산소 자극을 준 후 Hsp70의 발현 양상을 알아본 결과 4 시간에 Hsp70의 발현 양이 최고치를 보였으며, 이후 점점 발현 양이 감소하는 것을 관찰하였다. Hsp70의 발현을 유도하는 물질을 찾기 위해서 총 562개의 물질로 처리한 심근 세포에서 Hsp70의 발현 양을 Western blot immunostaining으로 측정한 결과 8개의 물질에 의해 Hsp70의 발현이 증가하였다. 이 중 thiamin을 처리한 심근 세포에서 저산소 자극 후에도 세포사가 적게 나타났으며, Hsp70의 발현 양상을 관찰한 결과 Hsp70의 발현이 24 시간동안 유지되었다. thiamin을 처리한 심근 세포가 thiamin을 처리하지 않은 세포에 비해 저산소 자극 후에 apoptosis가 적게 일어났으며, thiamin을 처리한 심근 세포에서 세포 생존에 관여하는 경로인 ERK1/2 MAP kinase의 활성화 형태인 인산화된 ERK1/2의 발현 양이 증가하였으며, 이는 Hsp 70과 관련이 있었다.

이상의 결과에서 저산소 상태의 심근세포에서 Hsp70의 발현은 단시간 내에 증가한 후 감소하는 양상을 보였으며, thiamin은 Hsp70의 발현을 유도하여 오랜 시간동안 발현이 유지되도록 함으로써 세포 보호 효과를 나타내는 것으로 생각된다. 특히 이의 기전은 Hsp70의 발현을 유도하여 caspase-3 활성도의 감소를 통한 apoptosis의 억제뿐만 아니라 ERK-MAP kinase의 활성화를 유지시켜 세포 생존 경로에 관여함으로써 이루어지는 것으로 생각된다.

[영문]Hypoxia is an important factor in cell death. In cardiomyocytes, hypoxic stress leads to permanent functional deficit following disruption of cell metabolism, cell swelling, ATP depletion and degradation of enzymes. Heat shock protein 70 (Hsp70) is known to be capable of protecting cardiac cells from lethal ischema hypoxia. The accumulation of Hsp70 in cardiac cells enhance myocardial resistance to hypoxic injury. The purpose of this study was to investigate the expression of Hsp70, novel Hsp70 inducing compounds and the protective mechanism of Hsp70 in cardiomyocytes under hypoxic injury.

Expression of Hsp70 was quantitatively evaluated using Western blot in cultured neonatal rat cardiomyocytes under 24 hour hypoxic stress. Expression of Hsp70 was increased shortly after the initiation of hypoxic insult and began to decrease 4 hours after the initiation of hypoxic insult. Screening of Hsp70-inducing compounds among 562 materials was performed. Eight compounds including thiamin were newly identified to induce Hsp70. Pretreatment with thiamin for 4 hours induced Hsp70 highly in a concentration-dependent manner in cardiomyocyte after 24 hours hypoxic injury, while cardiomyocytes exposed to only hypoxic stress without pretreatment of thiamin showed very low level expression of Hsp70. TUNEL assay and caspase-3 activity assay revealed that the degree of apoptosis was less in thiamin-treated cardiomyocytes than in control cardiomyocytes. Thiamin-treated cardiomyocytes sustained highly ERK1/2 phosphorylation at 6 hours after the initiation of hypoxic insult, while thiamin with Hsp70 inhibitor (KNK437)-treated cardiomyocyte showed low level of ERK1/2 phosphorylation at the same time point.

In conclusion, expression of Hsp70 increased shortly after the initiation of hypoxic insult, and then decreased. Thiamin is thought to be the cardioprotective agent against hypoxic injury through its induction of Hsp70 in cardiomyocytes. Hsp70 in hypoxic cardiomyocyte appears to have cytoprotective effect through ERK1/2-mediated cell survival pathway and interfering with the apoptotic pathways.