T-형 칼슘채널아형 클론의 발현과 조절

Abstract

[한글]

전압의존적 T-형 칼슘채널을 통한 세포 내로의 칼슘유입은 신경전달물질 방출, 호르몬 분비, 흥분성, 대사, 세포의 성장 및 분화, 그리고 생식 등의 장단기적인 생리적 기능들을 조절하는 데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 뿐만 아니라 T-형 칼슘채널이 유전적 또는 환경적인 요인들에 의해 비정상적으로 발현이 될 경우 간질, 심장병, 통증, 암 등의 여러 가지 병태생리학적 상황을 초래하는 것으로 알려져 있어 신약개발의 중요한 목표점이 되고 있다. 최근의 분자생물학적 연구들을 통해 T-형 칼슘채널은 a1G (Cav3.1), a1H (Cav3.2) 그리고 a1I (Cav3.3)의 세 가지 아형으로 이루어져 있음이 밝혀져 많은 연구자들의 관심을 받고 있다. 그러나 현재까지 이들 T-형 칼슘채널들의 생물리학적 특성과 일부 약리학적 특성이 알려졌지만 이들이 생리적으로 신경전달물질이나 호르몬에 의해 어떻게 조절되는 지는 밝혀지지 않고 있다. 따라서 본 연구의 목적은 첫째, T-형 칼슘채널아형 들 (a1G, a1H 및 a1I) 중 어떤 아형이 신경전달물질이나 호르몬에 의해 조절될 수 있는 지, 둘째, 조절된다면 세포 및 분자수준에서의 메커니즘이 무엇인지를 구체적으로 규명하는 것이었다. 이를 위해 T-형 칼슘채널아형 들을 각각 COS-7 세포와 상경신경절 세포에 여러 수용체와 함께 이종발현시킨 후 patch-clamp 라는 전기생리학적 방법으로 칼슘전류의 변화를 측정하고 분석하였다.

결과를 살펴보면 T-형 칼슘채널 아형 들 중에서 a1I만이 Gq/11에 연결되어 있는 M1 무스카린성, TRH 및 P2Y2 퓨린성 수용체의 활성에 의해 선택적으로 억제되었다. 반면에 Gi/o에 연결되어 있는 a2 아드레날린성, M2 무스카린성 수용체들의 활성에 의해서는 모든 T-형 칼슘채널아형들이 영향을 받지 않았다. T-형 a1I 칼슘채널의 억제정도는 최대 전류에서보다는 테스트자극의 200 ms (T200)에서 더 크게 나타났는데 이는 효현제 들이 칼슘전류가 비활성되는 속도를 현저히 증가시키기 때문이었다. 다음은 M1 수용체 효현제인 oxotremorine (Oxo-M)에 의한 T-형 a1I 칼슘채널의 억제에 관련된 신호전달 메커니즘을 단계별로 확인하였다. OxoM에 의한 T-형 a1I 칼슘채널의 억제는 GDPβS, Gpp(NH)p에 의해 차단되었기 때문에 heterotrimeric G 단백질이 관여함을 알 수 있었고, 여러 G 단백질 중에서 광견병 독소인 PMT에 민감한 Gq/11 단백질이 중요하다는 사실을 확인하였다. 뿐만 아니라 Gq/11 단백질의 a와 βγ subunit이 모두 T-형 a1I 칼슘채널의 억제에 중요하다는 사실을 확인하였다. 비특이성 protein kinase 차단제인 staurosporine을 전처치한 실험에서 OxoM에 의한 T-형 a1I 칼슘채널의 억제가 유의하게 차단되었다. 더 나아가 PKC를 활성화 시키는 PMA나 차단제인 GF109203X에 의해서 OxoM에 의한 T-형 a1I 칼슘채널의 억제가 차단되는 것을 관찰하여 protein kinase C (PKC)가 관여한다는 사실을 확인하였다.

결론적으로 본 연구를 통해 T-형 a1I 칼슘채널은 Gq/11에 연결된 수용체의 활성에 의해 선택적으로 억제되며, 그 억제의 메커니즘은 PKC에 의존적인 인산화과정을 통해 일어난다는 새로운 사실을 처음으로 규명할 수 있었다. 앞으로 본 연구결과는 T-형 칼슘채널이 가지고 있는 다양한 생리학적 기능의 조절을 이해하고, 이와 관련된 병태생리학적 상황의 원인을 규명하고 치료방법을 모색하는 데 중요한 기초정보를 제공할 것이다.

[영문]Ca2+ influx through voltage-dependent T-type Ca2+ channels (T-channels) is known to play critical roles in regulation of long- and short-term physiological functions such as transmitter release, hormone secretion, excitability, metabolism, cell growth/differentiation, and reproduction. Moreover, T-channels are implicated in various pathophysiological conditions including seizure, heart diseases, pain, cancer, etc. thus, being important targets for drug development. Recently, molecular biological studies have revealed that the T-channel subfamily consist of three iosofrms, a1G(Cav3.1), a1H(Cav3.2), and a1I(Cav3.3). To date, however, it remains unknown how these T-channel isoforms are physiologically regulated by transmitters and hormones although their biophysical and pharmacological properties have been in part disclosed. Accordingly, the purposes of the present study was firstly, to examine which T-channel isoforms can be regulated by transmitters and hormones, and secondly, to define the cellular and molecular mechanisms underlying the regulation of T-channel isoforms. In this regard, the changes in T-channel currents were electrophysiologically measured employing the patch-clamp technique in COS-7 cells or superior cervical ganglion (SCG) neurons heterologously expressing T-channel isoforms and receptors.

Among the T-channel isoforms, the a1I was selectively blocked by activation of M1 muscarinic, TRH, and P2Y2 receptors coupled to Gq/11. Conversely, none of the T-channel isoforms were affected by activation of Gio-coupled a2-adrenergic and M2 muscarinic receptors. The magnitude of the a1I blockade became larger at 200 ms of a test pulse (T200) than at peak of currents, which was mainly due to agonist-induced acceleration of the inactivation rate. Next, the signaling mechanisms were sequentially investigated for the a1I blockade by oxotremorine (OxoM), a M1 agonist. The OxoM-induced a1I blockade was prevented by GDPβS and Gpp(NH)p, indicating the involvement of heterotrimeric G proteins. Among different G proteins, more importantly, PMT-sensitive Gq/11 was responsible for the T-channel modulation. In addition, both Ga and Gβγ subunits were found to participate in the a1I blockade. In the experiments where COS-7 cells were pre-treated with staurosporine, a non-specific protein kinase antagonist, the OxoM-induced a1I blockade was significantly reduced. Finally, PMA, mimicked and GF109203X negated the T-channel modulation suggesting the involvement of PKC.

In conclusion, the present study first found that activation of Gq/11-coupled receptors selectively blocked the T-channel a1I via PKC-dependent phospho- rylation. This finding may provide important basis for understanding the various physiological functions of T-channels and for probing causes and therapeutic treatments of T-channel-related pathophysiological conditions.