백서 심근손상 모델에서 동종 세포이식 및 유전자 병합치료

Abstract

[한글]

허혈성 심장 질환으로 인한 심근의 괴사는 관상동맥 재관류 요법이나 관상동맥 우회로술로는 손상 받은 조직의 손상 정도를 경감할 수 있으나, 심근세포를 재생할 수는 없다. 따라서 심근세포로 분화하는 줄기 세포(stem cell)를 이식하여 심근세포를 재생하려는 많은 시도가 이루어지고 있다.

본 연구에서는 골수 간엽 줄기세포(bone marrow-derived mesenchymal stem cells; MSCs)를 냉동 손상 받은 심근에 이식하여 이식된 세포의 생존여부를 관찰하고, 성장인자인 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor-2: FGF-2)를 발현하는 유전자를 삽입한 경우에 이식된 세포의 생존능력과 분화정도에 차이가 있는지 관찰하고자 하였다. 백서의 골수세포를 획득하기 위하여, 백서의 대퇴골과 경골로부터 골수를 채취하고, Percoll gradient 방법으로 단핵구(mononuclear cell)를 분리 배양하면서 plate에 부착하지 않은 조혈모세포는 배제하고, 부착된 세포만 배양하여 골수 간엽 줄기 세포를 얻었으며, FGF-2 유전자를 삽입하고 이식 직전 DAPI처리를 통해 이식할 세포들을 표시하였다. 냉동손상은 액체 질소로 냉각된 cryo-probe을 노출시킨 심장의 좌심실 전벽에 충분한 시간동안 접촉시켜 괴사를 유도하였다. 냉동손상을 입은 부위의 주변부에 골수 간엽 줄기 세포를 이식하였으며, 이식한지 4주 뒤에 심장을 적출하여 이식한 세포의 생존 여부와 특성을 조사하였다. 연구 결과, DAPI-표지된 이식세포들이 이식부위에 생존하고 있음이 관찰되었고, 동일한 microscopic field에서 DAPI와 troponin T가 양성으로 염색되었으며, 심근세포에 특이적인 voltage-gated Ca2+ channel (Cav2.1)이 양성으로 염색되었다. 배양중인 골수 간엽 줄기 세포에서 atrial natriuretic peptide(ANP)와 brain natriuretic peptide(BNP) 유전자가 모두 발현되었고, DAPI-표지된 이식된 세포에서 myosin heavy chain과 α-skeletal actin 유전자의 발현 및 심근세포 특이적 전사 인자인 Nkx2.5와 GATA4 유전자의 발현이 관찰되어 이식된 세포가 분화된 심근 세포의 표현형을 보인다는 것을 알 수 있었다. 또한, FGF-2 유전자를 삽입한 경우 배양액으로 분비되는 FGF-2의 양이 대조군에 비해 증가함을 확인하였으며, troponin T와 voltage-gated Ca2+ channel의 발현이 대조군에 비해 증가되었고, 이식된 골수 간엽 줄기 세포의 생존율도 대조군에 비해 증가되었다.

결론적으로 본 연구에서 냉동 손상된 심근의 변연부에 골수 간엽 줄기세포를 이식할 경우 이식된 줄기 세포가 생존하며, 심근세포로 분화될 수 있는 가능성을 제시하였고, FGF-2 유전자 삽입은 이식된 세포의 생존율과 심근세포로의 분화를 향상시켰다.

[영문]Loss of cardiomyocytes in the myocardial infarction leads to regional contractile dysfunction, and necrotized cardiomyocytes in infarcted ventricular tissues are progressively replaced by fibroblasts to form scar tissue. To restore dead myocardium, we have isolated bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) in vitro and the FGF-2 gene were transfected into the isolated cells to enhance cell survival and differentiation after implantation. In in vitro culture, the isolated stem cells formed the colonies with fibroblast-like morphology after 2-week cultivation. They expressed atrial natriuretic peptide, brain natriuretic peptide, isoforms of contractile protein genes, such as myosin heavy chain, and α-actin, and cardiomyocyte-specific transcription factors, Nkx 2.5/Csx and GATA4. For the promotion of survival of implanted MSCs, FGF-2 gene was transfected into the MSCs by LIPOFECTAMIN PLUSTM reagent. The level of secreted FGF-2 into the culture medium was increased in the MSCs containing FGF-2 gene compared with the control MSCs containing lacZ(150¡3/418pg/ml VS. 21¡3/45pg/ml). In in vivo studies, 4 weeks after implantation of the MSCs on the cryo-injured host myocardium, viable cells labeled with 4'',6-diamidino-2-phenylindole was identified in host myocardium. The survival rate of MSCs containing FGF-2 gene was increa- sed at the ratio of 60%, compared with the control MSCs containing lacZ and the expression levels of troponin T and voltage-gated Ca2+ channel were increased in the MSCs containing FGF-2 gene compared with the control. Our studies indicated that locally delivered MSCs containing FGF-2 gene can reconstitute dead myocardium effectively.