Characterization of allergenic properties of German cockroach tropomyosin using recombinant proteins

Abstract

[한글]바퀴는 유전적 소인이 있는 사람들을 감작시켜서 알레르기 반응을 유발한다. 무척추동물의 트로포마이오신은 종종 알레르기 원인이 되며 교차반응성이 강하다. 바퀴 트로포마이오신 (Bla g 7)의 특성을 규명하기 위하여, cDNA 클로닝 후 재조합단백질을 합성하여 알레르기 발현성을 조사하였다. 기존에 밝혀진 트로포마이오신 서열에 근거하여 제조한 degenerate primers를 이용하여 역전사효소중합효소연쇄반응을 수행하여 바퀴 트로포마이오신의 cDNA를 클로닝하였다. 클로닝한 Bla g 7은 알레르겐으로 알려진 트로포마이오신의 아미노산 서열과 최고 98.5%의 상동성을 나타냈다. 클로닝한 cDNA를 이용하여 대장균에서 과발현시킨 후, Ni-nitrilotriacetic acid (NTA) agarose resin를 사용한 친화크로마토그래피의 방법으로 분리하였다. 효소면역흡착법 (ELISA)으로 재조합 트로포마이오신의 알레르기 발현성을 조사하였다. 효소면역흡착법 조사결과 재조합 Bla g 7의 감작율은 바퀴알레르기환자 중에서 16.2%였다. 재조합 트로포마이오신은 바퀴조항원 특이 IgE 반응을 32.4%까지 억제시킬 수 있었다. 트로포마이오신은 바퀴조항원에서 minor allergen으로 판명되었다.

재조합 트로포마이오신의 알레르기 발현성에 관한 보고는 일관적이지 못하다. 알레르기 발현성을 보다 잘 이해하기위하여, native와 재조합 바퀴트로포마이오신 (E. coli 발현 및 Pichia 발현)의 IgE 결합능을 비교분석하였다. Native 트로포마이오신은 ammonium sulfate 분획, hydroxyapatite column 크로마토그래피와 electroelution의 방법을 이용하여 분리하였으며, 알레르기 발현성이 native 트로포마이오신과 상응하는 재조합단백질을 합성하기 위하여 Pichia pastoris에서 발현시켰다. Native와 재조합 트로포마이오신의 알레르기 발현성은 효소면역흡착억제법으로 비교하였다. Native 바퀴트로포마이오신은 바퀴감작환자 혈청에서 17.6%의 IgE 반응을 나타냈다. 재조합 트로포마이오신은 융합단백질 없이 발현하였으며, N-말단은 native 단백질과 마찬가지로 blocking되었다. 면역효소흡착억제실험에서 재조합단백질은 1-1000 ng/mL의 농도에서 native 단백질과 비슷한 수준의 IgE 결합능을 가졌다. Native와 재조합단백질의 구조적 차이점 이외의 다른 요소가 여러 트로포마이오신의 상이한 IgE 반응성에 영향을 주는 것으로 사료된다.

다양한 원천으로부터 유래한 각각의 알레르겐은 아미노산서열이 다양성을 갖는다고 보고되었다. 알레르겐의 IgE 반응성을 연구하기 위해서는 서열의 다양성이 미치는 영향을 고려하여야 한다. 재조합 Bla g 7을 면역한 마우스혈청을 이용하여 2차 전기영동과 면역이적법을 수행하여 단백질 수준에서의 isoforms에 관한 연구를 하였다. 역전사효소중합효소연쇄반응을 수행하여 아미노산 서열이 다른 11개의 variants를 찾았다. 바퀴트로포마이오신은 아미노산 서열의 변이가 심하지 않아서 알레르기 발현성에 큰 영향을 주지 않을 것으로 사료된다. 본 연구결과는 절지동물 트로포마이오신의 교차항원성에 관한 분자생물학적 기초를 제시한다. 중합효소연쇄반응의 반응산물을 이용하여 재조합단백질 단편을 합성하고, 면역효소흡착법으로 IgE 결합능을 조사하였다. 실험에 사용한 7명의 환자혈청은 모두 상이한 IgE 결합 반응을 나타냈다. 본 연구결과는 하나의 단백질이 여러 개의 IgE-항원결정부위를 갖는 것으로 판명되었다.

재조합바퀴트로포마이오신을 면역하여 생산한 단클론항체를 이용하여 two-site ELISA를 개발하여, 집먼지내의 트로포마이오신 농도를 측정하였다. Two-site ELISA의 detection limit는 재조합트로포마이오신은 8 ng/mL, 바퀴조항원은 1 ㎍/mL이었다. 9 곳의 침구먼지로부터 단지 3 곳에서 트로포마이오신이 검출 (24.20 ± 32.11 ㎍/g dust)되었으며, 13 곳의 부엌먼지로부터 단지 한 곳 (6.80 ㎍/g dust)에서 트로포마이오신이 검출되었다. 본 실험결과는 한국인의 낮은 트로포마이오신 감작율과 일치한다.

본 연구결과 바퀴트로포마이오신의 감작율과 알레르기 발현성을 결정하는 가장 중요한 요소는 구조적 특성이나 아미노산 서열의 변이가 아닌 집먼지내 알레르겐 농도와 같은 환경적 요인으로 생각된다.

[영문]Cockroach infestation may sensitize and elicit allergic responses to genetically predisposed individuals. Invertebrate tropomyosins are a frequent cause of allergy and highly cross-reactive in nature. For the initial characterization of German cockroach tropomyosin (Bla g 7), cDNA cloning, expression of recombinant protein, and investigation of its allergenicity were performed. German cockroach tropomyosin was cloned by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) using degenerate primers designed on the basis of known tropomyosins. The cloned Bla g 7 shared up to 98.5% amino acid sequence identity with other allergenic tropomyosins. The cloned cDNA was over-expressed in Escherichia coli and purified by affinity chromatography using Ni-nitrilotriacetic acid (NTA) resin. The allergenicity of the recombinant tropomyosin was examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). ELISA showed a recombinant Bla g 7 sensitization rate of 16.2% to German cockroach allergic sera. Recombinant Bla g 7 was able to inhibit 32.4% of the specific IgE binding to cockroach extract. Tropomyosin represents a minor allergen in cockroach extracts.

The allergenicity of the recombinant tropomyosins derived from various arthropods are not coherent. To gain a deeper insight into the allergenicity, the IgE-binding reactivities of native and recombinant German cockroach tropomyosins (E. coli-expressed and Pichia-expressed) were compared. Native tropomyosin was purified by ammonium sulfate fractionation, hydroxyapatite column chromatography, and electroelution. Recombinant tropomyosin was expressed in Pichia pastoris in an attempt to produce the recombinant protein which is comparable to natural counterpart in allergenicity. The allergenicity of native and recombinant tropomyosins was compared by ELISA inhibition study. Native German cockroach tropomyosin showed 17.6% IgE binding reactivity from German cockroach sensitized sera. Recombinant tropomyosin was produced without fusion protein and the N-terminus was blocked as a native counterpart. Its IgE binding reactivity was comparable to that of native tropomyosin over the concentration range of 1 to 1000 ng/mL in the ELISA inhibition test. Besides the structural differences of native and recombinant proteins, other factors may also influence on the various IgE reactivities of tropomyosins.

Diverse amino acid sequences have been described for individual allergens from various sources. The effects of such sequence diversity need to be considered with respect to IgE binding reactivity of an allergen. Two-dimensional (2-D) gel electrophoresis and immunoblot analysis using mouse anti-recombinant Bla g 7 serum were performed to investigate isoforms at the protein level. RT-PCR was applied to examine the sequence diversity. Eleven different variants of deduced amino acid sequences were identified. German cockroach tropomyosin has only minor sequence variations, which do not seem to affect the allergenicity significantly. These results support the molecular basis underlying the cross-reactivity of arthropods tropomyosins. Recombinant fragments were also generated by PCR and IgE-binding epitopes were assessed by ELISA. The sera of seven patients'' revealed heterogeneous IgE-binding responses. This study demonstrates multiple IgE-binding epitope regions in a single molecule.

A two-site ELISA was developed using monoclonal antibodies (mAbs) raised against recombinant German cockroach tropomyosin, and was applied to assess the invertebrate tropomyosin level in house dust samples. The detection limit of the developed two-site ELISA was determined to be about 8 ng/mL for recombinant German cockroach tropomyosin and 1 ㎍/mL for German cockroach whole body extract. Tropomyosin was detected in three samples (24.20 ± 32.11 ㎍/g) from nine bedding samples (33.3%) and in only one (6.80 ㎍/g) of 13 kitchen dust samples (7.7%). These data support the low rate of sensitization to cockroach tropomyosin in Korean respiratory allergy patients.

The results of the present study led us to conclude that the most important determinant of the sensitization rate and allergenicity of German cockroach tropomyosin is not the structural characteristics or amino acid sequence variations, but the environmental factors such as distribution in house dust.