Comparison of anti-gamma hemoglobin antibody and CD71 antibodies in isolation of fetal nucleated erythrocytes from maternal blood

Abstract

[한글]

임신중 모체혈액에서 태아 유핵 적혈구는 비침습적 산전 진단에 가장 많이 이용된다. 태아 적혈구는 항 감마 헤모글로빈이나 CD71에 의해 분리될 수 있다. 현재 가장 보편적인 태아세포 농축방법은 density gradient로 단핵세포층을 분리해내고, 태아헤모글로빈의 구성 물질인 항 감마 chain을 표지자로 이용하여 모체혈액에서 FACS로 태아 유핵 적혈세포를 농축시킨 후 FISH를 이용하여 현미경 관찰을 하는 방법이다. 그러나, FACS는 상당한 숙련도를 요하며 시간이 많이 걸리고 장비도 비싸다. CD71 표면항체는 전혈(whole blood)을 대상으로 MACS를 이용하는 것으로서 항체의 크기 및 농축 방법에 따라 1 단계 ferrofluid 분리인 immunicon, 2단계 ferrofluid 분리인 miltenyi, 그리고, 2단계 dynal bead 분리 등 세 가지가 있다. 본 실험의 일차 목적은 이들 세가지 CD71 항체와 항 감마 헤모글로빈 항체를 FISH, 양적 중합효소연쇄반응, 그리고 FACS후 FISH 결과를 비교하여 모체 혈액에서 태아 유핵 적혈구를 분리해내는 최적의 항체를 선택하는 것이다. 태아혈액을 성인의 혈액에 spike한 샘플과 임신을 종결시킨 모체혈액을 샘플로 하여 실험하였다. 항 감마 헤모글로빈 항체를 가지고 FACS로 sorting한 후 얻어진 슬라이드와 3가지 다른 CD71 항체를 이용하여 얻어진 샘플을 smear하여 얻어진 슬라이드를 XY signal에 근거하여 FISH를 한 결과, 항 감마 헤모글로빈 항체가 태아 적혈구를 가장 높은 yield를 나타내었다. 일부 샘플에서는 Y-specific probe를 가지고, 양적 중합효소 연쇄반응을 하였는데, MACS를 통하여 분리된 CD71 항체가 유핵 적혈구외에 다른 적혈구의 오염이 많이 됨으로써 오히려 떠 높은 분포를 나타내었다. 그러나, 각각의 항체에 의하여 농축된 샘플을 항 감마 헤모글로빈 항체로 염색한 후 FACS를 통하여 cytometry profile과 purity (sorting된 세포 중 태아 유핵 적혈구의 비율)를 비교해 본 결과, 항 감마 헤모글로빈 항체가 다른 CD71 항체보다 높은 purity를 보였다. 결론적으로, 항 감마 헤모글로빈 항체가 태아 유핵 적혈구를 분리해 내는 최적의 항체임을 알 수 있었다.

본 연구는 임상적용이 가능하고 최적의 효과를 얻기 위하여, 위의 실험을 배경으로 하여 우선 임신을 종결시킨 모체 혈액에 적용하였다. 항 감마 헤모글로빈항체를 가지고 모체 혈액을 농축한 후, sorting을 통하여 태아 유핵적혈구를 얻었다. 최근 개발된 태아 유핵적혈구 scoring system을 이용하여 태아 유핵적혈구의 가능성이 높은 세포를 미세조작을 이용하여 회수하고, 회수된 세포가 실제로 태아 기원의 세포인지를 확인하기 위하여, 3가지 STR primer를 이용하여 DNA 다형성의 차이를 분석할 수 있는 형광 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 두 명의 21 삼염색체 증후군, 각각 한 명의 18과 13 삼염색태 증후군 태아를 가진 산모 혈액을 대상으로 실험하였다. 염색체 18에 있는 marker D18S535는 4명 모두에서 정확한 정보를 나타내었으며, 특히 18 삼염색체 증후군 태아 혈액에서는 3개의 peak를 보여주었다. 21번 염색체에 있는 D21S1411는 4명중 3명, 그리고, D21S11는 4명중 2명에서 정보를 나타내었고, 따라서 다운증후군임을 증명할 수 있었다. 결론적으로, 본 연구에서 확인된 방법은 향후 염색체 이상을 가진 태아를 산전 진단하는 비침습적 방법으로 이용 가치가 높고, 기존의 FISH를 이용한 방법을 대체할 수 있으며, 앞으로 유전학적 산전진단 방법에 있어서 많은 DNA source를 제공 할 수 있을 것으로 사료된다.

[영문]

Intact fetal nucleated red blood cells (NRBCs) in maternal blood during pregnancy can serve as a source for prenatal genetic diagnosis. NRBCs are identified by an intracellular marker such as hemoglobin or a cell surface marker such as CD71. The gamma chain of fetal hemoglobin is frequently used as a unique fetal NRBC identifier and CD71 is expressed in most fetal blood cells. In an attempt to further maximize the potential of genetic analysis from fetal cells isolation, FNRBC recovery with direct anti-gamma hemoglobin staining after density gradient and depletion was compared with three different whole blood magnetic separations (1-step from Immunicon and 2-step ferrofluid from Miltenyi, 2-step Dynal beads from Dynal). In model systems such as quantitatively defined spikes of fetal into adult blood, as well as blood samples after surgical termination procedures, fetal cell yield and purity through the results of FISH, quantitative real time PCR, and FACS were calculated. The yield of total number of cells with a XY signal after FISH was the highest on direct anti-gamma hemoglobin staining. After normalizing the results of each experiment to the corresponding result from anti-gamma hemoglobin staining (1), ratio is 0.42 in 1-step ferrofluid, 0.33 in 2-step ferrofluid, and 0.76 in 2-step dynal beads. The fetal cell purity is clearly better in direct anti-gamma hemoglobin staining than that of the magnetic separation from whole blood. The median ratio is 56.3% in anti-gamma hemoglobin staining, 7.7% in 1-step ferrofluid, 6.5% in 2-step ferrofluid, and 31.4% in 2-step dynal beads.

We applied fluorescent polymerase chain reaction after fetal cell isolation using the erythroblast scoring system and micromanipulation. In all four cases analyzed the candidate fetal NRBCs were determined to be of fetal origin by at least two sets of STR markers. This determination was made when candidate fetal NRBCs shared one or two allele(s) with the maternal WBCs while the other allele(s) was (were) clearly different from the maternal WBCs. Fetal alleles were detected in four of four cases with the marker D18S535, in three of four with D21S1411, and in two of four with D21S11.

This study shows that the direct anti-gamma staining is the best fetal cell recovery system and it is very useful to isolate fetal nucleated red blood cells as a non-invasive genetic source.