Saxatilin의 안구 내 신생혈관발생에 미치는 효과 및 기전 규명

Abstract

[한글]

신생혈관과 관련된 안과질환은 실명의 중요한 원인이다. 그 대표적인 질환은 당뇨망막증, 연령관련 황반변성증, 미숙아망막증 등이다. 이들 질환의 근본적인 발병원인은 각기 다르지만 비정상적인 신생혈관생성으로 인해 실명이 된다. 따라서 최근에는 암 치료 분야에 적용되는 많은 신생혈관억제제들이 안과분야에 적용되고 있다. 본 연구에서는 각막 및 망막 신생혈관발생을 유발한 동물모델을 통해서 RGD서열을 포함하는 disintegrin인 saxatilin의 신생혈관 억제효과를 알아보고 정확한 기전을 밝히는 것을 목적으로 하였다. ROP 동물모델을 통해서 암 치료제로 사용되는 농도(이하 고농도) 및 그 이하 농도(이하 저 농도)를 투여한 후 관찰한 결과 흥미로운 결과를 보였다. 고농도(1-10 mg/kg/day)에서는 예상대로 비정상적인 신생혈관을 억제하였으나 발생 중인 정상적인 망막혈관의 성장도 방해받는 것이 관찰되었다. 하지만, 저 농도(100 μg/kg/day이하)에서는 비정상적인 신생혈관 억제 뿐 아니라 정상적인 조건에서의 망막 혈관 network와 유사하게 망막 혈관이 형성되는 것으로 관찰되었다. 이 농도는 기존의 작용기전으로 알려진 경쟁적 부착 억제(competitive adhesion inhibition)에 의한 고형암 억제효능을 보이는 1 mg/kg/day보다 1000배 이하의 낮은 농도이다.

또한 VEGF로 유도시킨 각막 신생혈관 생성 동물모델에서 saxatilin은 5 mg/kg/day의 고농도 처리 군에서는 VEGF에 의해 유도되는 혈관을 억제시켰으나, 10 ng과 1 μg/kg/day의 낮은 농도조건으로 처리한 결과 신생혈관을 억제시키기보다는 정상상태에 가까운 혈관이 형성되는 것이 관찰되었다. 한편 saxatilin이 in vitro 상태에서 혈관 내피세포의 증식에 미치는 영향에 대한 조사를 통해 saxatilin 130 nM 까지는 내피세포의 증식 속도를 더 증가시키거나 감소시키지 않는다는 결과를 얻었다.

Saxatilin이 저 농도에서 발생중인 혈관구조의 성숙에 영향을 미쳤다는 것에 착안하여 in vitro 실험으로 미세관 형성 조사(microtubule assay)와 세포 이동 조사 (migration assay)를 수행하였다. 그 결과 saxatilin을 100 ng/ml(13 nM) 로 처리한 실험 군이 정상대조군에 비해 미세 관 형성이 보다 양호한 것을 관찰하였다. 또한 소 모세혈관 내피세포(Bovine capillary endothelium; BCE)의 이동 실험에서도 100 ng/ml 처리농도에서 정상대조군에 비해 이동이 증가함을 알 수 있었다. ROP 동물모델에서 saxatilin의 정상적인 혈관에 유사한 성장 효능은 saxatilin이 세포의 이동과 미세관 형성을 돕는 기작으로 설명이 가능해졌다. Saxatilin의 이동 및 미세관 형성의 영향은 RGD서열과 관련되어 있는 FAK의 발현과 인산화정도를 측정하므로서 관련되어 있음을 증명하였다. FAK은 saxatilin 10 ng/ml 처리농도 이상에서 과 발현되었으며, 인산화도 많이 일어났다.

이상의 결과로부터 신생혈관형성에 있어 disintegrin계열인 saxatilin은 혈관형성억제 효능 및 혈관 형성촉진 효능이 모두 존재하며, 처리농도에 따라 효능이 달리 나타난다는 사실이 관찰되었다. VEGF에 의해 유도된 혈관형성에서 saxatilin은 내피세포의 증식을 유도하지 않으나, 세포 이동 및 관 형성에 영향을 미침으로서 혈관구조형성에 영향을 미치는 것으로 보인다.

[영문]

Neovascularization in the eye can cause visual loss ,the most common of which are proliferative diabetic retinopathy, neovascular age-related macular degeneration, and retinopathy of prematurity. There is growing evidence that anti-angiogenic drugs will improve future therapies of diseases like cancer, rheumatoid arthritis and ocular neovascularisation. There are currently more than 30 angiogenesis inhibitors in clinical trials and a multitude of promising new candidates are under investigation in vitro and animal models. This study was aimed to reveal whether saxatilin, disintegrin containing RGD sequence, prevent ocular angiogenesis, and to investigate accurate biochemical mechanism of saxatilin on angiogenesis in eye. The effects of saxatilin were examined in oxygen-induced retinopathy in the mouse. At high dosage of saxatilin (above 1 mg

kg/day), it inhibited not only abnormal vessel growth, but also normal vessel development. However, mice treated with low dosage of saxatilin (range from 1 μg/kg/day to 100 μg/kg/day) had significantly less oxygen-induced retinal neovascularization than did vehicle-treated mice and formed near normal retinal vessel network. Also, I used the cornea micropocket assay of neovascularization to investigate the effect of saxatilin on neovascularization in vivo. Pellets containing VEGF alone included corneal neovascularity extending from the limbus across the cornea. After daily intraperitoneal injection of 5 mg/kg saxatilin, VEGF-induced neovascularization was inhibited. However, the administration of low dosage of saxatilin (10 ng, 1 μg/kg) daily promoted significantly neovascularity than VEGF alone. Fluorescent microscopic findings demonstrated enhanced length of vessel and vascular network maturation. In vitro, saxatilin did not enhance or inhibit proliferation of endothelial cells in treatment with the concentration range from 0.1 ng/ml to 1 μg/ml. The effect on maturation of vessel using low dosage of saxatilin was investigated by means of the migratory response of endothelial cells to saxatilin and the measurement of ability of endothelial cell to form three dimensional structures(tube formation). Treatment with 100 ng/ml saxatilin increased significantly cell migration and promoted tube formation. In addition saxatilin appeared to induce FAK overexpression and phosphorylation, which might be to the increase of cell migration. These results indicate that high dose of saxatilin have both antiangiogenic effects and low dose of saxatilin have proangiogenic effects.