사람 유방암의 진행단계에 따른 종양세포의 간질침윤과 미세혈관 생성 조절 및 액와 림프절 전이 예측인자

Abstract

[한글]

현재까지 알려진 유방암의 가장 중요한 독립적인 예후 인자는 종양의 크기와 림프절 전이 유무이다. 그러므로, 유방암 환자에 있어서 림프절 전이 유무를 정확하게 발견하는 것과 림프절 전이를 예측할 수 있는 인자를 알아내는 것은 환자의 치료방침을 정하는데 있어 매우 중요하다. 전이를 하기 위해서 종양세포는 이웃 종양세포와 분리되어 기저막을 뚫고 간질조직에 침윤한 후 맥관 내로 들어감으로써 타 장기 또는 림프절로의 전이가 이루어진다. 따라서, 일차적으로 단백분해효소에 의한 기저막의 융해와 간질의 미세혈관 생성 및 혈관 생성인자의 역할이 중요하다. 간질침윤 조절인자 가운데 matrix metalloproteinase (MMP)는 기저막과 세포외 기질을 분해하는 중요한 단백분해효소로서 이들 중 기저막의 중요한 성분인 제4형 콜라겐을 분해하는 MMP2와 MMP9은 유방암, 대장암, 피부암, 폐암 등의 여러 장기의 종양조직에서 보고되어 있으며 상당수의 연구에서 이들의 발현과 종양의 국소 침윤, 림프절 전이, 생존율과의 상관성을 보고하고 있다. 또한, MMP는 종양세포와 간질세포 사이에서 밀접한 연관성을 가지면서 종양의 성장 및 진행에 중요한 역할을 하며 전이의 필수적 요소인 혈관 생성과도 밀접한 상관관계가 있다고 알려져 있다. 최근에는 미세혈관 생성에 중요한 역할을 하는 MMP2를 활성화시킬 뿐만 아니라 직접적으로 단백분해 작용도 하는 것으로 알려진 MT1-MMP가 발견되어 이의 생물학적 역할에 대한 연구가 활발하다.

종양세포의 침윤과 전이에 관여하는 또 다른 중요한 인자는 세포표면 부착물질인 CD44로서 이를 매개로 종양세포의 성장을 촉진시키는 기전의 많은 부분은 잘 알려져 있지 않으나 최근의 유방암 세포주를 이용한 연구에서 CD44와 MMP 및 TGF-β1이 일련의 상관관계가 있다고 보고하였다. 즉, CD44가 MMP9을 종양세포 표면에 위치시켜 CD44-MMP9 결합체를 형성함으로써 MMP9으로 하여금 TGF-β1을 활성화시켜 종양의 침윤 및 혈관 생성을 조절한다는 것이다.

따라서, 본 연구에서는 조기 유방암인 관상피내암종과 T1 또는 T2의 침윤성 관상피암종을 대상으로 유방암의 진행에 따른 종양세포 증식능과 종양의 미세혈관 증식 정도를 알아보고 혈관 생성인자인 VEGF, TGF-b1 및 CD44의 면역조직화학 염색과 간질침윤 조절인자로 알려진 MMP2, MMP9, TIMP2와 MT1-MMP의 mRNA 인시투 보합실험을 통하여, 이들의 발현 및 상호 간의 연관성과 림프절 전이를 예측할 수 있는 인자를 알아봄으로써 향후 유방암 환자의 치료방침을 정하는데 도움을 주고자 연구를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 유방암 종양세포의 증식지수는 임상 및 병리학적 예후 인자인 임상병기, 종양의 크기, 조직학적 등급, 핵 등급에 따른 유의한 차이를 보였고 (p<0.05), 종양의 미세혈관 밀도, 혈관 생성인자, 액와 및 감시 림프절 전이와는 직접적인 상관관계를 보이지 않았다.

2. 종양의 미세혈관 밀도는 관상피내암종에 비하여 침윤성 관상피암종에서 증가하였으나 통계학적으로 유의한 차이는 없었고 두 군 간에 혈관 생성인자인 VEGF와 TGF-β1 발현의 통계학적 차이도 없었다.

3. 관상피내암종과 침윤성 관상피암종의 MMP2, MMP9, TIMP2 및 MT1-MMP mRNA 발현에 유의한 차이는 없었다. 또한, 침윤성 관상피암종의 조직학적 등급, 핵 등급에 따른 MMP2, MMP9, TIMP2 및 MT1-MMP mRNA 발현에도 유의한 차이가 없었다.

4. CD44std는 침윤성 관상피암종보다 관상피내암종에서, 임상병기가 낮을수록, 조직학적 등급 및 핵 등급이 낮을수록 높은 발현율을 보였으며(p<0.05) MMP mRNA와의 유의한 상관성은 없었다.

5. 액와 및 감시 림프절 전이가 있는 경우 MT1-MMP mRNA, VEGF와 TGF-b1 발현율이 의의 있게 높았고, MT1-MMP와 혈관 생성인자인 VEGF 간에는 유의한 상관관계를 보였다(p<0.05).

6. 간질침윤 조절인자 중 MT1-MMP mRNA 발현과 TIMP2 mRNA 발현 간에는 유의한 상관성을 보였으나(p<0.05) 다른 MMP 간에는 유의한 상관성이 없었다.

이상의 결과로 보아 간질조직 침윤에 관여하는 MMP2, MMP9, TIMP2, MT1-MMP mRNA는 병리학적으로 침윤이 확인되기 전인 상피내암종의 단계에서 이미 생성됨을 확인하였다. 또한, 액와 및 감시 림프절 전이와 MT1-MMP, VEGF 및 TGF-β1 발현은 유의한 상관관계를 보이므로 이들 인자는 유방암 환자의 예후를 추정할 수 있는 인자로 여겨진다. 간질침윤 조절인자 중 MT1-MMP와 TIMP2 mRNA 발현은 유의한 상관관계를 보이므로 앞으로 이들 단백분해효소의 정량적 분석 방법을 통해 활성화된 형태의 상대적인 양을 측정함으로써 실제적인 생물학적 역할을 이해할 수 있으리라 기대한다.

[영문]In breast cancer, tumor size and nodal status are still the most important prognostic indicator. Therefore, it is important to detect nodal metastasis with accurate and prompt way and to find out predictable factor of nodal metastasis. To metastasize, a cancer cell must separate from its neighbors, penetrate the basement membrane, force its way through the surrounding stroma and subsequently enter into the circulation, eventually metastasize to other organ or lymph node. Therefore, primarily, this process requires degradation of basement membrane and the role of angiogenesis and angiogenetic factor is crucial. Among the MMPs, potent proteolytic enzymes, MMP2 and MMP9 are involved in degradation of basememt membrane and extracellular matrix. In the previous reports, expression of MMPs has been correlated with local invasion, lymph node metastasis and survival in various cancers. Recently, MT1-MMP was found, which specifically induces activation of proMMP2 on the tumor cell surface, thus triggering the invasion of tumor cells and acts directly cleavage of substrate.

Also, CD44, a cell surface adhesion molecule, may play an important role in promoting tumor invasion and metastasis. The mechanism underlying CD44-mediated enhancement of tumor growth has remained obscure. Recent report has shown that CD44 can localize active MMP9 to the tumor cell surface and activates TGF-β1 and promotes tumor invasion and angiogenesis.

In this study, we examined the expression and tissue localization of MMP2, MMP9, MT1-MMP, TIMP2 mRNA by in situ hybridization and microvessel density, VEGF, TGF-β1, CD44std by immunohistochemical staining and studied correlation between their expression in ductal carcinoma in situ (DCIS) and T1 or T2 invasive ductal carcinoma of the breast. Also, we compared it with clinicopathological parameters and evaluated the predictable factor of nodal metastasis. The results are as follows;

1. Tumor proliferative index of breast cancer was significantly correlated with clinical stage, tumor size, histologic grade and nuclear grade (p<0.05), but, was not significantly correlated with microvessel density, angiogenic factor, axillary and sentinel nodal status.

2. Microvessel density was more increased in invasive ductal carcinoma than in DCIS without statistical significance. Expression of VEGF and TGF-β1 was not statistically different between DCIS and invasive ductal carcinoma.

3. Expression of MMP2, MMP9, TIMP2 and MT1-MMP mRNA was not statistically different between DCIS and invasive ductal carcinoma. Also, they have no statistical difference according to histologic grade and nuclear grade of invasive ductal carcinoma.

4. Expression of CD44std was significantly increased in DCIS compared to invasive ductal carcinoma (p<0.05). Also, it was significantly increased in low clinical stage, low histologic and nuclear grade of invasive ductal carcinoma (p<0.05). However, CD44std expression was not correlated with MMPs mRNA.

5. Axillary and sentinel nodal metastasis was significantly correlated with MT1-MMP mRNA, VEGF and TGF-β1 and MT1-MMP mRNA was significantly correlated with VEGF (p<0.05).

6. Among the MMPs, MT1-MMP mRNA was significantly correlated with TIMP2 mRNA (p<0.05) and other MMPs were not correlated with each other.

In conclusion, these mRNA expression patterns suggest production of MMP2, MMP9, MT1-MMP, TIMP2 mRNA in the stage of carcinoma in situ even prior to overt invasive growth. MT1-MMP mRNA, VEGF and TGF-β1 are significantly correlated with axillary and sentinel nodal metastasis and may be considered as prognostic indicator in breast cancer.