연결단백에 의한 상피세포 내강막 수송단백의 기능 조절

Abstract

[한글]

CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)은 cAMP에 의해서 활성화되는 이온 수송단백으로서 상피 내강의 중탄산염 분비에 매우 중요한 역할을 한다. CFTR의 카르복실기 말단은 PDZ(PSD-95/discs large/ZO-1)부위를 갖는 여러 연결단백과 결합한다. 이러한 결합으로 CFTR은 커다란 단백복합체를 형성하게 되어 자신의 Cl- 통로 활성 및 음이온 교환단백 등의 다른 이온 수송단백의 활성도 조절한다.

연결단백은 신경세포에서 이온 수송단백이 밀집된 신경접합 후 말단에 많이 존재하여 결합단백의 위치를 고정할 뿐 아니라 관련 이온 수송단백의 활성조절에도 관여한다. 상피세포는 뇌세포처럼 극성을 띄고 있으며 내강으로의 분비 조절에는 이온 수송단백의 조화된 작용이 필요하므로 이러한 연결단백의 기능이 필수적이다.

본 연구에서는 먼저 yeast two-hybrid 결과를 통해 CFTR이 Shank2 연결단백과 결합할 수 있다는 사실을 새로이 밝혔다. Shank2 단백은 한 개의 PDZ 부위, 한 개의 프롤린 다량함유부위 및 SAM 부위로 구성되어 있다. 면역조직화학법을 통하여 Shank2 연결단백은 뇌세포의 접합 후 밀집 부위 외에 췌장 관 구조 중 특히 CFTR이 위치하는 내강막에 주로 밀집되어 있음을 확인하였다. CFTR과 Shank2의 상호작용은 동물 세포에서도 재현되었으며 둘 간의 상호작용은 Shank2의 PDZ부위를 통한 것임을 Shank2의 PDZ부위의 돌연변이 유도로 확인하였다. Patch clamp 실험과 CFTR 의존적 음이온 교환단백 활성실험을 통하여 Shank2는 CFTR의 Cl- 통로활성을 감소시키고, CFTR 의존적 음이온 교환단백의 활성 또한 감소시킴을 확인하였다. 세포표면단백 biotin 표지실험을 통하여 세포막에 발현하는 CFTR 단백 양을 비교한 결과 Shank2가 오히려 CFTR 단백의 단백 안정성을 증가시키는 경향을 나타내었다. 그러나 CFTR의 활성화기전인 인산화 정도는 Shank2가 함께 발현하는 경우에 적게 일어나는 것을 확인하였다.

이상의 결과를 볼 때 CFTR의 인산화 감소를 통해 CFTR 관련 이온 수송단백의 활성이 저하된다고 생각되며 Shank2 단백은 CFTR의 과도한 활성을 막거나 CFTR의 활성을 종식시키는 생리적 기능을 하는 것으로 생각된다.

[영문]

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a cAMP-activated membrane transporter, which controls electrolyte and fluid transport in a variety of epithelia. The C-terminus of CFTR has PDZ (PSD-95/discs large/ZO-1)-binding motif and is known to interact with several PDZ-domain proteins. It was known that PDZ-domain proteins perform essential roles in membrane stabilization and activity regulation of ion transporters in neuronal cells. Accumulating evidence suggests that protein-protein interaction performs an important role in transepithelial ion transport. The present study aimed to identify the PDZ proteins expressed in epithelia and to investigate roles of the scaffolds in epithelial transport.

Using RT-PCR, pancreatic epithelia were found to have several PDZ proteins, including SAP97, PSD95, and Shank2. Among them, Shank2 showed a possible protein interaction with transporters in the luminal membrane of epithelia such as CFTR, NHE3, and hNBC3 (NBCn1) in a yeast two-hybrid screening. Shank2-CFTR interactions were also verified by co-immunoprecipitaion experiments in a mammalian expression system. In immunostaining, Shank2 was co-localized with CFTR in the luminal membrane of several epithelia including rat pancreatic duct cells. The mutagenic experiments on 109His residue of Shank PDZ domain revealed that the protein interaction through PDZ domain is essential in Shank2-CFTR association. CFTR chloride channel and CFTR-dependent anion exchanger activities were measured in a heterologous expression system. Interestingly, both activities were reduced by Shank2 over-expression. To identify the underlying molecular mechanisms of activity reduction, in vivo phosphorylation assay and surface biotinylation assay were performed. Accordingly, cAMP-induced phosphorylation of CFTR was decreased by Shank2 expression.

Conclusively, decreased activity of CFTR was caused by reduction of CFTR phosphorylation. Above result indicate that Shank2 performs preventing excess activation of CFTR or performs ceasing the CFTR activity.