성장인자가 배양한 인체진피 미세혈관 내피세포의 이동에 미치는 영향

Abstract

[한글]

세포의 이동성은 창상치유, 염증반응, 태자발생 등의 중요한 생체변화에 필수적인 조건이며, 특히 혈관 내피세포의 이동에 따른 혈관신생은 종양, 망막혈관증, 창상치유, 조직이식, 피판의 생존 및 심근경색 등에서 매우 중요한 분야이다.

세포의 이동속도는 세포막의 확장 (extension), 접촉 (attachment), 분리 (detachment)와 세포외 기질과의 유착도 (adhesiveness)가 세포의 이동에 중요한 영향을 미치는데, 유착도는 세포의 배양시기 (seeding time), confluency, 배지의입체적인 구조, 세포의 표현형

(phenotype of cells)에 따라 다르게 변화한다. 또한 혈관 내피세포의 이동에는 fibroblast growth factor (FGF), transforming growth factor (TGF),vascular endothelial growth factor (VEGF) 등의 성장인자가 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

혈관 내피세포의 이동에 대한 이해는 혈관신생 기능을 조절하여 임상적으로 종양, 망막혈관증, 관절염 등에서 혈관신생을 억제하고, 심근경색, 피판 등에서는 혈관신생을 촉진시킬 수 있는 일이 가능하다고 생각되며 또한 최근의 조직 공학 발달에 기인하여 생체 재료내의 혈관신생을 촉진하여 주변 조직과의 친화력 촉진 등에 이용될 수도 있을 것이다. 그러므로 본 연구에서는 bFGF, TGF-β1, VEGF가 배양한 인체진피 미세혈관 내피세포의 이동에 미치는 영향을 밝히고자 하였다. 사용된 미세혈관 내피세포는 human neonatal dermal microvascular endothelial cell (CC-2505, BioWhittker Inc., Walkersville , MD, USA)로 3~4번의 계대 배양한 세포들을 사용하였으며 배지는 basal medium과 single Quots가 함유된 상태의 endothelial cell basal medium-2 MV (EGM-2 MV) Bullet kit system (CC-3202, BioWhittker Inc., Walkersville, MD, USA)을 사용하였다.

세포의 이동성에 영향을 미치는 적정량의 성장인자의 농도를 확인하기 위해서, 각각의 성장인자의 농도를 5가지 (0.01 ng/ml, 0.1 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml)로 하여 실험하였고, 배양된 내피세포는 이동성 평가를 위해 약 380㎛ 직경의 홀을 가진 실리콘

고무 (두께 0.5 mm)가 표면에 덮여진 well plate위에 2×102 개 이하가 되게 세포를 주입한 후 CO2 배양기에서 24시간 배양하고, time-lapse video microscopy를 이용해서 24시간 실시간으로 세포의 이동을 관찰하고 이를 평가하였다. 성장인자를 투여한 실험군에서 대조군에 비해 세포의 이동속도가 증가되었으며 bFGF와 TGF-β1는 1 ng/ml에서 VEGF에서는 10 ng/ml에서 혈관 내피세포의 이동속도가 가장 빨랐다. 각각의 성장인자에 따른 이동속도는 bFGF는 1 ng/ml에서 8.736 ± 0.948 μm/hr, TGF-β1은 1 ng/ml 에서 9.859 ± 1.904 μm/hr, VEGF는 10 ng/ml에서 10.293 ± 1.612 μm/hr로 VEGF가 이동속도를 가장 빠르게 증진하는 것으로 나타났으며, TGF-β1와 bFGF의 순으로 이동속도에 영향을 미치는 것으로 나타났다.

본 실험을 통해, 세포의 이동을 객관적으로 측정할 수 있었으며 이는 종양, 망막혈관증, 조직이식, 피판 및 심근경색 등에서 혈관신생의 제어 가능성을 제시하였으며 또한 인조혈관 등의 조직 공학과 결합하여 혈관신생을 촉진시키는 등의 임상적 응용이 가능하다고

생각되어지며 특히 단순한 성장인자의 세포 이동에 끼치는 영향의 유무 뿐만 아니라, 배양한 인체 미세혈관 내피세포와 같은 특정 세포에 대한 성장인자 별로의 이동성을 수치화해서 그 차이를 확인할 수 있었다는데 그 의의가 있겠다.

[영문]

Cell migration is essential for many important biological events, including embryonic development, wound healing, inflammatory response, and tumor metastasis. As a result of

endothelial cell migration, angiogenesis is very important factor in embryogenesis, wound healing, tumor development, flap survival. Angiogenesis is dependent on endothelial cell proliferation, migration and motility is one of the most essential for many important biological events. The speed of cell migration is regulated by extension, attachment, detachment of

cell membrane and ahhesiveness of cell to extracellular matrix. Growth factors such as FGF, TGF, VEGF is well known to play a major roles in the migration of endothealial cells.

This study was designed to compare the motilities of human dermal microvascular endothelial cell (HDMEC) in growth factors such as bFGF, TGF-β1 & VEGF. The motility of cultured HDMEC was compared using a video-microscopy system that was developed in

combination with a self-designed CO2 mini-incubator. To determine migration speed, cells were viewed with a 4 phase-contrast lens and video recored. Images were captured using a color CCD camera and saved in 8-bit full-color mode.

Experimental Groups were divided into four groups: group I (with a Control, HDMEC only), group II (HDMEC with bFGF), Group III (HDMEC with TGF-β1), Group IV (HDMEC with VEGF).

At the concentration of 1 ng/ml (bFGF), 1 ng/ml (TGF-β1), and 10 ng/ml (VEGF) as the most effective dose for cell migration through preliminary study, the speed of migration is 8.736 ± 0.948 μm/hr, 9.869 ± 1.904 μm/hr, 10.293 ± 1.612 μm/hr, respectively. These data shows that groups with growth factor accelerate the HDMEC migration than a control group, and the VEGF is most effective growth factor in the HDMEC migration than bFGF and TGF-β1