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제대혈에서 내피기원세포 분리 및 배양을 통한 분화 유도

DC Field Value Language
dc.contributor.author신정원-
dc.date.accessioned2015-11-22T07:19:08Z-
dc.date.available2015-11-22T07:19:08Z-
dc.date.issued2001-
dc.identifier.urihttps://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/127589-
dc.description의과학사업단/박사-
dc.description.abstract[한글] 면역성 감염 질환의 병인 규명으로 시작된 "혈관신생"의 개념이 창상 치유와 종양 전이의 기전을 이해하는데 적용되고 나아가 이를 죽상경화성 심장질환 및 다른 허혈성 질환 치료에 적용하려는 노력이 시도됨에 따라, 혈관신생의 기원이 되는 내피기원세포에 대한 연구의 필요성이 제기되었다. 본 연구에서는 말초혈액보다 면역학적으로 미성숙하고 증식능이 큰 제대혈로부터 내피기원세포를 분리하여 그 성상을 규명하고 배양 과정에서 vascular endothelial growth factor(VEGF), interleukin-1β (IL-1β) 및 fibroblast growth factor-basic(FGF-b)을 포함한 여러 가지 싸이토카인, 특히 thrombopoietin(TPO)이 내피기원세포 증식에 미치는 효과를 관찰함으로써, 체외 대량 배양을 시도하고 내피기원세포를 이용한 치료의 기술적, 이론적 배경을 확립하고자 하였다. 18명의 산모로부터 채취한 제대혈에서 Ficoll-Hypaque 및 MACS system(Miltenyl Biotech,Auburn, CA, USA)을 이용하여 CD34 양성 세포를 분리하였으며, 분리된 CD34 양성 세포는 총 단핵구의 평균 0.32%이었고 순수도는 평균 84.04%이었다. CD34 양성이면서 CD38 음성 인 원시조혈모세포는 단핵구 중 0.05%, CD34 양성 세포 중 7.44%였으며, AC133과 Flk-1/KDR이 모두 양성인 내피기원세포는 단핵구 중 0.15%, CD34 양성 세포 중 1.73%이었다. CD34 양성 세포에 다양한 조합의 싸이토카인을 첨가하여 배양한 결과, 기본 조합인 VEGF, IL-1β, FGF-b에 stem cell factor와 flt3-ligand 및 TPO를 모두 첨가하였을 때 부유 세포 및 부착 세포수가 가장 많이 증가되었으며, 다른 싸이토카인이 모두 존재하는 상태에서 TPO를 첨가하였을 때의 부유 및 부착 세포수가 TPO를 첨가하지 않았을 때보다 통계적으로 유의하게 높게 나타나 TPO가 내피기원세포에서 내피세포로의 분화에 직접적으로 기여하는것으로 생각되었다(p<0.05, Wilcoxon rank sum test). 또한 배양 3일째에 비 부착 세포를 회수하여 동일한 조건에서 다시 배양하였을 때 부착 세포가 형성되는 것을 확인함으로써,3일 배양 중 조혈모세포가 내피기원세포로 재증식(repopulation)하는 것을 간접적으로 증명하였다. CD34 양성 세포로부터 4주간 배양된 부착 세포의 표지자 분석 결과 내피세포 특이표지자인 KDR과 CD31 및 CD62E는 발현되었으나 CD34와 CD117 및 CXCR-4는 거의 발현되지 않아 적절한 싸이토카인 종류 및 조합에 대한 연구가 더 필요할 것으로 생각되었다. 그러나 배양 과정에서 내피세포의 특징인 cord-like structure 및 cobblestone 모양을 관찰함으로써, 배양된 부착 세포가 내피세포임을 확인할 수 있었다. 이상의 실험으로 제대혈에서 분리된 CD34 양성 세포에서 내피기원세포의 성상을 규명할 수 있었으며 체외 배양을 통하여 제대혈 단핵구 중 극소수에 불과한 내피기원세포로부터 내피세포로의 분화를 유도하였고, 이 과정에 TPO가 기여함을 증명함으로써 내피기원세포의 수적인 한계를 극복할 수 있는 실험적인 조건을 제시하였다. [영문] The concept of "neovascularization", which was first applied to understand the pathogenesis of some immunologic diseases such as diabetic retinopathy or rheumatoid arthritis, has been extended to other fields of study such as myocardial ischemia and tumorigenesis. In addition, endothelial progenitor cells(EPCs) have been reported to have the capacity to colonize vascular grafts. In this study, EPCs were isolated from cord blood and cultured to observe the effect of various cytokines, such as vascular endothelial growth factor(VEGF), interleukin-1β , fibroblast growth factor-basic(FGF-b), stem cell factor(SCF), flt3-ligand(FL), and thrombopoietin(TPO) for the development of endothelial cells(ECs) as a source of cells for antineoplastic therapy or treatment of regional ischemia. The cord blood was collected in sterile blood bags containing CPDA-1 from 18 normal full-term deliveries. Mononuclear cells(MNCs) were isolated using Ficoll-Hypaque, and CD34+ cells were isolated by MACS system(Miltenyl Biotech, Auburn, CA, USA). CD34+ cells were 0.32% of total MNCs and the recovery rate by MACS system was 84.04%. CD34+/CD38- cells, considered as primitive stem cells, were 0.05% of MNCs and 7.44% of CD34+ cells. AC133+/KDR+ cells, considered as EPCs, were 0.15% of MNCs and 1.73% of CD34+ cells. To evaluate the effect of various cytokines, especially TPO, CD34+ cells were cultured under the conditions of various cytokine combinations with VEGF, IL-1β and FGF-b as the basic. The numbers of suspension and adherent cells were the highest when supplemented with SCF, FL and TPO. The addition of TPO in the presence of the other cytokines significantly increased the numbers of suspension and adherent cells(p<0.05, Wilcoxon rank sum test). After three days of culture, non-adherent cells were recovered and recultured under the same conditions for additional three days. As a result, adherent cells were reformed, therefore it was considered hematopoietic cells were repopulating to EPCs during the first three days. After four weeks of culture, adherent cells were analyzed for endothelial markers by tow-color flow cytometry. Cultured adherent cells expressed the endothelial specific markers, such as KDR, CD31, and CD62E, but did not express CD34, CD117 and CXCR4. Typical morphology of endothelial cells were observed, such as cord-like structure and cobblestone appearance during culture period, which suggested that the adherent cells were consistent with endothelial cells. In conclusion, we characterized the EPCs in CD34+ cells isolated from cord blood and confirmed that TPO plays a major role in the differentiation from EPCs to endothelial cells. Finally, we suggested experimental condition in which can provide large volume endothelial cells for the potential use of therapeutic neovascularization.-
dc.description.statementOfResponsibilityopen-
dc.publisher연세대학교 대학원-
dc.rightsCC BY-NC-ND 2.0 KR-
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/kr/-
dc.title제대혈에서 내피기원세포 분리 및 배양을 통한 분화 유도-
dc.title.alternativeIsolation of endothelial progenitor cells from cord blood and induction of differentiation by ex vivo expansion.-
dc.typeThesis-
dc.contributor.alternativeNameShin, Jeong Won-
dc.type.localDissertation-
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1. College of Medicine (의과대학) > Others (기타) > 3. Dissertation

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