Tetrameric HLA class I-peptide 복합체를 이용한 B형 간염 바이러스 특이 CD8+ 림프구의 정량 분석

Abstract

[한글]B형 간염 바이러스(hepatitis B virus: HBV)의 조절에는 HBV의 항원성을 나타내는 다양한 HBV 에피토프에 대한 세포독성 T 림프구의 반응이 중요한 것으로 보고되고 있다. 현재까지 HBV 특이 세포독성 T 림프구를 직접 측정할 수 있는 방법이 개발되어 있지 않았으나 최근 분자 생물학적 기법의 발전으로 tetrameric HLA class I-peptide 복합체(이하 tetramer로 함)를 이용하여 바이러스 특이 CD8 T 림프구를 직접 규명할 수 있게 되었다. 이에 지금까지 HLA-A2 양성 환자의 60% 이상에서 세포독성 T 림프구에 의해 인식되는 것으로 알려진 HBV의 대표적인 세가지 에피토프, core 18-27, polymerase 575-583, envelope 335-343과 결합된 HLA-A2 tetramer (각각, Tc 18-27, Tp 575-583, Te 335-343으로 함)를 합성하여 유속세포 분석기(flow cytometry)를 이용, 급성 간염에서의 HBV 특이 세포독성 T 림프구를 직접 정량하고 감염 경과에 따른 이 세포의 빈도, 표현형(phenotype)과 클론 증식능의 변화를 임상 자료와 함께 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 세 종류의 tetramer는 모두 각각의 에피토프에 특이한 세포독성 T 림프구 클론과 세포군에서만 반응을 보였으며 tetramer 특이 세포는 세포독성과 IFN-γ 합성 기능을 유지하고 있었다.

2. 14명의 HLA-A2 양성 환자중 11명에서 tetramer 특이 CD8 T 림프구가 전체 혈중 CD8 세포의 0.1%이상으로 증가되어 있었으며 12명의 환자중 11명에서 Tc 18-27 특이 CD8 세포의 빈도가 다른 에피토프 특이 림프구보다 높았다. 간염 경과에 따른 HBV 특이 CD8 T 림프구의 빈도는 급성기에 가장 높았으며 회복기에 감소하였다.

3. 임상 양상 발현 2주째에 가장 높은 빈도의 core 18-27 특이 CD8 T 림프구가 tetramer 염색에 의해 관찰되었으나 이 시점에서의 chromium release assay 결과는 음성이었으며 생체외 자극에 잘 증식하지 않았다. 반면 Tc 18-27 특이 세포의 빈도가 2주에 비해서 낮았던 3, 5주 및 회복기(14주)의 chromium release assay 결과는 오히려 높은 수준의 세포독성 T 림프구 반응이 관찰되었고 이 시기의 Tc 18-27 특이 세포의 증식능은 매우 컸다.

4. 급성기의 HBV 감염시에는 75∼98%의 Tc 18-27 특이 세포에서 HLA-DR과 CD38이 표현되어 활성화 되어 있었으며 회복기에는 HLA-DR과 CD38의 표현이 완전히 감소하면서 CD62L이나 CD45RA도 표현되지 않아 클론 증식능의 회복과 일치하는 소견을 보였다.

이상으로 HBV 간염 환자를 대상으로 tetramer를 이용, HBV 특이 CD8 세포를 직접 정량 분석함으로써 기존의 분석 방법에 비해 생체 내에서 일어나는 면역 반응을 보다 정확하게 규명할 수 있게 되었다.

[영문]Cytotoxic T cells have been suggested to be responsible for lysis of hepatitis B virus (HBV)-infected hepatocytes and control of virus infection. The frequency, kinetics, phenotype, and capacity for clonal expansion of circulating HBV-specific CD8 cells were analyzed directly in patients with acute HBV infection to clarify their pathogenetic role. Three HLA-A2 peptide tetramers able to visualize HBV core, envelope, and polymerase epitope- specific cytotoxic T lymphocytes were synthesized and used for flow cytometric analysis of antigen-specific populations.

The results obtained were as followed;

1. HLAA2/HBV peptide tetramer binds only to peptide specific cytotoxic T lymphocyte.

2. HLAA2/HBV peptide specific cells are functionally able to lyse target cell and produce cytokine.

3. HLAA2/HBV peptide specific cells are easily detectable in the peripheral blood of acute HBV patients.

4. CD8 T lymphocyte specific for core are found at a higher frequency than those specific for envelope and polymerase in most patients with acute HBV.

5. The number of HBV-specific CD8 cells is highest during the clinically acute stage of infection and decreased after recovery.

6. HBV-specific CD8 cells express an activated phenotype and have an impaired capacity to expand in vitro and to display cytolytic activity in response to peptide stimulation during the acute clinical stage of disease.

7. Recovery of these functions was observed when the frequency of tetramer specific CD8 cells decreased, coincident with a progressive decrease in their expression of activation markers

This study provides the first ex vivo evidence that the highest frequency of circulating HBV-specific CD8 cells coincides with the clinically acute phase of hepatitis B. These cells exhibit an activated phenotype with limited further proliferative capacity that is restored during recovery.