가와사끼병 환자에서 IL-6 유전자 promoter의 polymorphisms

Abstract

[한글]가와사끼병은 소아에서 발생하는 전신형 염증성 혈관염으로 아직 그 원인이 밝혀져 있지 않지만 급성기 혈중의 IL-6치의 증가와 관련이 있을 것으로 생각되고 있다. 그 증거로는 급성기 혈중의 IL-6치가 발열기간, 혈관염의 지표가 되는 가용성 E-selectin, T 세포의 활성지표인 혈중의 가용성 IL-2R와 상관관계가 있으며 임상적으로도 급성기 염증의 지표가 되는 혈중 CRP와의 상관관계가 있다는 점, 회복기에 혈소판이 급격하게 증가한다는 점은 IL-6가 골수의 megakaryocyte의 숙성과 관련을 지을 수 있겠고, 또한 회복기에 손가락과 발가락의 탈피는 IL-6가 keratinocyte 숙성과 관련이 있다는 것 등을 들 수 있다.

이러한 혈중 IL-6의 증가가 IL-6 유전자의 polymorphism으로 인하여 초래될 수 있는 지를 알아보기 위하여 1999년 1월부터 12월까지 연세의료원에서 가와사끼병으로 진단 받은 환자 10명과 정상대조군 10명을 대상으로 하여 본 연구를 실시하였다. 혈청 IL-6은 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 대상자의 말초혈액에서 genomic DNA를 추출하고 IL-6 DNA의 5'-flanking region의 유전자 서열을 GenBank에서 검색하고 이중 전사조절 부위를 선정하여 primer를 제작하였으며, PCR에 의한 genomic DNA를 증폭하여 sequencing하여 mutation site를 분석하였다. 의심되는 mutation site에 대하여 site-directed mutagenesis를 시행하고 IL-6 promoter-luciferase 융합 plasmid를 제조하고 CV-1 cell에 transfection시켜 mutation된 부위의 기능을 조사하였다.

가와사끼병의 급성기 혈중 IL-6치는 136.9 pg/ml로 현저히 증가하였다가 회복기에는 20.9 pg/ml로 의미 있게 감소하였고(p<0.01) 정상 대조군에서는 5 pg/ml이하였다. 가와사끼병 환아를 대상으로 IL-6 유전자 promoter 부위의 염기서열을 조사한 결과 IL-6의 증가와 연관되어 있다고 알려진 -174bp 부위의 G/C polymorphism은 발견할 수 없었고 가와사끼병과 질병이 없는 정상 아동 사이의 promoter gene 염기서열에서도 차이를 발견할 수 없었다. 하지만 우리나라 소아의 IL-6 promoter 염기서열과 이미 보고된 wild type의 염기서열에서는 7부위에서 차이를 발견할 수 있었다. -55bp 부위에서 A의 G substitution이 있었고 -810bp 부위에는 GGGCTG의 insert와 -816bp 부위의 G deletion을 관찰할 수 있었다. 나머지 다섯 부위는, -66bp 부위에 T insert, -142bp 부위에 C insert, -579bp 부위에 G deletion, -666bp 부위에 C insert, 그리고 -770bp 부위에 GC insert를 관찰할 수 있었다. 돌연변이가 IL-6 발현에 미치는 영향에 대한 연구를 시행한 결과 -55bp 부위에서 G의 substitution과, -810bp 부위의 GGGCTG insert와 -816bp 부위의 G deletion은 IL-6 분비에 영향을 미치는 돌연변이임을 확인할 수 있었다.

결론적으로 다른 질환이나 정상 아동과 비교하여 볼 때, 가와사끼병 환자에서 IL-6 유전자 promoter부위의 polymorphism은 발견할 수 없었으나, 미국인과 비교하여 한국인에서 볼 수 있는 polymorphism을 발견할 수 있었고 이러한 polymorphism은 IL-6 유전자의 발현에도 영향을 미치는 것으로, 미국인과 한국인 사이에서 IL-6에 의하여 유발될 수 있는 질병의 종류 및 병리생태나 증상 등에 차이를 보일 수 있을 가능성이 있음을 시사한다.

[영문]During the acute phase, patients with Kawasaki disease(KD) demonstrate a drastical increase in serum interleukin-6 (IL-6) that parallels the duration of fever. To investigate the possibility that this cytokine profile results from a difference in the control of IL-6 expression, the promoter of the IL-6 gene was examined for polymorphisms.

Genomic DNAs from the patients with KD and normal controls were extracted from blood samples collected at our hospital. The promoter region was amplified by PCR and sequenced. We detected several interesting promoter polymorphisms: GGGCTG insertion at -810 bp and G deletion at -816 bp positions (M1), A to G substitution at -55 bp (M2) of the reported IL-6 gene promoter sequence. And other consistent sequence variations different from the reported sequence were also observed at several positions: -66 bp (T insertion), -142 bp (C insertion), -579 bp (T deletion), -666 bp (C insertion), and -770 bp (GC insertion), which may suggest a sequencing error of the reported sequence. There were no significant differences in the nucleotide sequence between the KD patients and normal control groups.

By preparing IL-6 gene promoter-luciferase reporter fusion plasmid constructs [pGL3-IL-6-wild type, -M1, -M2, -(M1+M2)] and transient transfection assays in HeLa and CV-1 cells, we tested the functional significances of the polymorphisms (M1 and M2). Mutations at these positions significantly decreased luciferase expression (p<0.05), suggesting the promoter elements at which the mutations were introduced are important in transcriptional activation of IL-6 gene. IL-1 and LPS potently stimulated luciferase expression on the wild type and mutant reporter constructs [M1, M2, (M1+M2)], suggesting that the mutation may affect the interaction with transcription factors critical in the transcription of IL-6.

These polymorphisms in IL-6 may be manifested in different pathophysiology or symptoms of disease believed to be related to IL-6.