각막내피세포 뮤신층의 성상과 생성기원

Abstract

[한글]각막내피세포는 각막의 투명성 유지에 중요한 역할을 한다. 현재 안과영역에서 흔한 질병인 백내장 수술시 발생할 수 있는 내피세포의 과도한 소실은 시력을 잃게 하고, 나아가 각막이식수술을 받게 되는 주요 요인이 되고 있다. 그러므로 안과수술 중 각막내피세포의 보호는 항상 중요한 과제로 여겨지고 있다. 최근 각막내피세포의 표면이 점액 층으로 싸여 있다는 보고가 있었고, 이에 관한 많은 연구가 이루어지고 있다. 본 연구에서는 이 점액 층의 성상과 생성기전에 관해 알아보고자 하였고, 이러한 연구는 추후 각막내피세포의 보호방안과 점탄성 물질의 개발 시 중요한 자료가 될 것으로 사료된다.

점액층의 주성분은 뮤신이고, 뮤신은 중앙의 단백질을 중심으로 주변에 많은 당질이 붙어있는 형상을 하고 있으므로, 이 당질 층의 조성을 알아보기 위해 lectin을 이용하여 성분염색을 하였다. 각각 특정 당질과 부착하는 11가지의 lectin 염색에서 모두 양성반응을 보였고, 그중 RCA-1, PHA-E, SNA, WGA, MAA, CON-A는 강한 양성반응을 보였으며, PNA 의 경우 중등도 반응을, SBA, LCA, DBA, UEA-I에서는 약한 양성반응을 보였다. 즉 각막내피세포를 덮고있는 점액 층은 뮤신을 구성하는 요소인 여러 종류의 당질로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다.

뮤신의 위치와 구조상의 특성을 알아보기 위해 WGA lectin-gold complex를 이용하여 투사 전자현미경 관찰을 한 결과, WGA lectin-gold 입자가 각막 내피세포 내 주머니 형태, 내피세포 표면, 그리고 세포밖에 존재하는 뮤신층 내에서 관찰되었다. 즉 뮤신이 각막내피세포에서 생성되고 내피세포 내에서 주머니 형태로 존재하다가 세포 밖으로 배출되는 것임을 알 수 있었다. 그리고 뮤신이 각막내피세포막 밖을 덮고 있는 점액층의 구성성분임을 알 수 있었다.

인체 각막내피세포 뮤신층의 생성기전과 생성원류를 알아보고자 각막에서 비교적 흔하며, 각막상피세포에서도 발견되는 뮤신인 MUC1의 존재를 밝히고자 하였고, 3가지의 분자생물학적 실험을 하였다. 인체 각막내피세포의 역전사 중합효소 연쇄반응결과 기존에 알려진 MUC1 mRNA와 같은 크기의 산물을 관찰할 수 있었다. 각막내피세포의 MUC1의 역전사 중합효소 연쇄반응산물인 368 bp의 밴드를 정제하여 E. coli(DH-5α)에 부차클로닝 한후 자동염기서열분석기를 이용하여 염기서열을 분석한 결과 이미 밝혀져 있는 MUC1의 염기서열과 일치하여, 증폭된 역전사 중합효소 연쇄반응산물의 염기서열이 MUC1임을 확인하였다. 그리고 in situ hybridization을 이용하여 MUC1 mRNA의 분포를 살펴본 결과 MUC1 mRNA가 각막내피세포 핵 주위에 존재함을 알 수 있었다. 또한 기존의 MUC1의 존재가 입증되어 있는 인체 각막상피를 양성 대조군으로 사용하여 시행한 웨스턴 블롯팅에서 각막내피세포도 같은 크기의 MUC1 단백질이 존재함을 알 수 있었다. MUC1에 대한 항체를 이용한 면역조직화학 염색상 인체 각막내피세포의 안쪽과 바깥쪽에서 염색 양성 소견을 관찰할 수 있었다.

이상의 결과로 각막내피세포 표면에는 여러 종류의 lectin과 반응하는 당질이 풍부한 층이 있음을 확인할 수 있었고, 적어도 뮤신의 일종인 MUC1이 존재하는 것을 알 수 있었다.

[영문]Corneal endothelial cells play a major role in the maintenance of corneal transparency. Excessive loss of corneal endothelial cells during ECCE (Extracapsular cataract extraction), which is one of the most common operations in ophthalmology, results in loss of vision and eventual corneal transplantation. Therefore, the protection of corneal endothelial cell during ECCE is indeed significant.

Recently, there have been reports showing that the corneal endothelial cell surface is covered by a mucous layer. In this study, we investigated the nature of this corneal endothelial mucous layer and the biochemical mechanism of mucin production. These data may be useful in the search for a new viscoelastic material and an innovative protection method for the corneal endothelial cells.

The major component of the mucous layer is mucin and this mucin consists of a core protein with peripheral carbohydrate branches. We stained the carbohydrate of mucin with specific lectin to find out the component of the carbohydrate. All the lectin staining results showed positive findings. (RCA-1, PHA-E, SNA, WGA, MAA, Con-A :strong positive; PNA: moderate; SBA, LCA, DBA, UEA-I: weak.) The results obtained showed that the mucous layer covering the corneal endothelial cells consists of various kinds of carbohydrate which constitute mucin.

To determine the location and structural characteristic of mucin, we observed WGA lectin-gold complex with transmission electron microscopy. WGA lectin-gold particle was found in the endothelial cell as a vesicular shape located on the surface of endothelial cell and in the separated mucous layer. This suggested that mucin was produced in the corneal endothelial cells, remained in the vesicle, and secreted. The results confirmed that mucin is one of the components of mucus layer overlying the corneal endothelial cell. To confirm the biochemical mechanism of mucin production by corneal endothelial cells, we performed 3 kinds of molecular biologic studies using MUC1, which is present in the cornea. We had detected a MUC1 mRNA band from the RT-PCR results of human corneal endothelial cells, which coincides with the positive control band. Using in situ hybridization, silver grains were observed around the nucleus in human corneal endothelial cells representing the expression of MUC1 mRNA in the corneal endothelium. According to Western blot, MUC1 antibodies produced positive signals. Immunohistochemical studies on human corneal sections showed positive statining for the protein product of MUC1 in corneal endothelium.

The results of this study showed that there was a carbohydrate-rich layer which reacts to various lectins on the corneal endothelial surface and MUC1 is one of the components of this layer.