담석증에서 분자생물학적 방법을 통한 Helicobacter species등 세균 감염에 대한 역할규명

Abstract

[한글]담석 중 갈색석의 병인으로 세균감염이 하나의 원인으로 인정받고 있지만 콜레스테롤석의 형성은 세균감염과는 무관한 것으로 생각되어 왔다. 그러나 최근 분자생물학적 방법으로 혼합콜레스테롤석의 대부분에서 세균 DNA가 추출됨으로써 세균감염이 콜레스테롤석의 형성에도 관여하며, E. coli와 같은 그람음성 균주의 감염이 주된 원인으로 생각되고 있다. 한편, 최근에는 여러 소화기질환에서 Helicobacter pylori (이하 H. pylori)에 대한 다양한 연구들이 진행되고 있으며 새로운 종류의 Helicobacter들도 발견되고 있다. 담석증을 포함한 담도질환에서도 H. pylori 또는 H. pylori에 대한 특이 항체가 있음이 발견되었고, 만성담낭염 환자의 담낭점막과 담즙에서 Helicobacter sp.가 검출되어 이 균주들이 담낭질환과 관련이 있을 것이라고 추측되고 있다. 그러나 아직까지 담석자체에서 Helicobacter가 검출된 보고는 없으며 더욱이 담석증환자에서 담낭점막, 담석 및 담즙에서 체계적으로 Helicobacter sp.를 검출한 연구는 국내외적으로 매우 드물다.

이에 본 연구에서는 콜레스테롤석의 병인으로 세균감염의 역할을 규명하고자 세균 16S rRNA에 대한 primer로 세균의 존재를 규명하고 그 균주를 동정하고자 하며, 담석증 환자의 담석자체와 담즙, 담낭점막에서 Helicobacter에 특이적인 primer를 이용하여 H. pylori를 포함한 hepatic Helicobacter sp.의 감염여부를 확인하고 염기서열 분석을 통하여 그 균주를 규명하고자 하였다.

증상 담낭담석증으로 인하대병원에 입원하여 수술적 담낭제거술을 시행 받은 58예를 대상으로 하였으며 담석, 담즙 및 담낭점막을 무균적으로 채취하였다. 담석은 내부를 잘게 갈고, 담즙 및 담낭점막에서 DNA를 추출한 후 세균의 16S rRNA에 대한 primer로 PCR을 시행하였다. 담석에서 검출된 DNA는 E. coli specific β-glucuronidase gene (uidA)에 대한 primer로 nested PCR을 시행하였고 또한 직접 염기서열 분석을 하여 세균을 동정하였다. 검출된 세균 DNA는 Helicobacter genus 특이 primer로 PCR을 시행한 후 H. pylori의 26 kDa 표면항원에 대한 primer로 PCR을 시행한 후 직접 염기서열 분석을 통해 균을 동정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 대상환자 58예의 담석을 육안적 성상 및 콜레스테롤 함량에 의거해 분류한 결과 순수콜레스테롤석은 10예, 혼합 콜레스테롤석 36예 및 갈색석 12예이었다.

2. 36예의 혼합 콜레스테롤석에서 bacterial 16S rRNA에 대한 PCR결과 25예(69.4%)에서 양성으로 관찰되었나 순수콜레스테롤 담석에서는 10예 중 1예(10%)에서만 양성으로 나타났다. 갈색석에서는 9예(75%)에서 세균 DNA가 검출되었다.

3. 세균 PCR 양성인 26예를 대상으로 E. coli (uidA)의 primer를 이용한 nested PCR결과 23예(88.4%)에서 양성으로 관찰되어 검출된 세균의 대부분은 E. coli이었다. 또한 담석에서 검출된 PCR 산물 중 17예에 대해서는 직접 염기서열분석을 시행하였는데 8개의 담석에서 E. coli에 대한 염기서열로 분석되었고 5예에서는 Pseudomonas로 2예는 Citrobacter sp., 2예는 Klebsiella sp.로 판정되었다.

4. 콜레스테롤석 46예 및 12예의 갈색석을 포함한 총 58예 중 세균 DNA가 검출된 35예의 담석에서 Helicobacter genus 특이적인 primer를 이용하여 PCR을 시행한 결과 4예(11.4%)에서 양성을 보였다. 담즙(48예)에서는 24예(50%)에서 세균 DNA가 검출되었으며 Helicobacter sp.는 6예(25%)에서 검출되었다. 담낭점막(46예)에서는 18예에서 세균 DNA (39.1%)가 검출되었고 이중 5예(27.7%)에서 Helicobacter sp.에 양성이었다. 따라서 Helicobacter sp. 검출률은 담석에서는 4/58 (6.8%), 담즙 6/48 (12.5%), 담낭점막은 5/46 (10.8%)이었다.

5. Helicobacter 16S rRNA로 증폭된 PCR 산물을 H. pylori의 26 kDa 표면항원에 대한 primer로 PCR한 결과 담석 4예 중 4예, 담즙은 6예 중 5예, 담낭점막은 5예 중 3예에서 검출되었다.

6. Helicobacter 16S rRNA amplicon (400 base pair)에 대한 직접 염기서열을 분석한 후 NCBI의 BLAST의 염기서열과 일치하는 세균을 찾아본 결과 담석에서는 4예 모두가 H. pylori와 100% 일치하였다. 담즙은 6예 중 5예에서 H. pylori와 일치하였고, 담낭 점막에서는 5예 중 3예에서 H. pylori와 일치하였다.

이상의 결과로 혼합콜레스테롤석의 대부분에서 세균 DNA가 검출되어 혼합콜레스테롤석의 형성에 세균감염이 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 또한 담석증 환자의 담석, 담즙, 담낭 점막에서 H. pylori가 발견되었음은 지금까지 위십이장질환에 주된 관련이 있다고 알려져 왔던 H. pylori가 담석증을 포함한 담도계 질환의 한 원인으로 작용할 수 있음을 시사하는 중요한 소견으로 생각되며, 향후 이 균주가 어떤 경로로 담도계로 유입되었는지 또는 다양한 담도계 질환과의 상관관계에 대한 규명이 필요할 것으로 생각된다.

[영문]The pathogenesis of gallstone formation is still unclear. However considerable date implicate bacteria in the formation of brown pigment gallstones. In contrast the formation of cholesterol gallstones is believed to depend mainly on cholesterol saturation and solubility. Recently some authors documented bacterial DNA in mixed cholesterol gallstone (cholesterol content 55∼90% of weight) and suggested that the bacteria or bacterial products may play a role in the formation of cholesterol gallstones.

There are increasing reports Helicobacter pylori (H. pylori) and other Helicobacter species were detected in various human tissues such as stomach, liver, bile, and gallbladder tissue. Several studies have been reported that H. pylori or H. pylori specific antiboby in human bile samples although its pathological role is not clear. Recent reports on the association of Helicobacter sp. with gallbladder disease show discrepant results. The discrepancy may be explained by regional differences in the distribution of Helicobacter sp.. There is no reports for the detection of Helicobacter sp. in gallstones itself.

Therefore we have attempted to detect bacterial DNA in cholesterol gallstones and identify the species of bacteria. Also we studied the presence and identification of Helicobacter sp. in gallstone, bile and gallbladder mucosa from patients with gallbladder stones. Gallbladder stones, bile and gallbladder mucosa were obtained using strict aseptic technique from 58 patients (10 pure cholesterol, 36 mixed cholesterol and 12 brown pigment gallstones) with symptomatic patients with gallbladder stones. The DNA was extracted from crushed gallstones. gallbladder epithelium, and bile. Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify bacterial 16S rRNA and uidA (encoding E. coli) in crushed cholesterol gallstones. PCR products were sequenced and resulting sequences were compared to databases accessed through the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Geneinfo BLAST network server. Gallstones (58), bile (48) and gallbladder mucosa (46) were subjected to PCR analysis using Helicobacter genus-specific 16S rRNA primers to generate amplicons of approximately 400 bases. The Helicobacter 16S rRNA amplicons were sequenced and analyzed to compare with databases to identify the species. Also we attempted PCR to detect H. pylori by primer with H. pylori 26 kDa surface Ag. The results were as follows.

1. Bacterial DNA were detected in 25 (69.4%) of 36 mixed cholesterol gallstones. In contrast only one (10%) of ten pure cholesterol gallstones yielded a product.

2. The 23 PCR products (88.4%) of 26 were revealed as DNA of E. coli by nested PCR with E. coli specific β-glucuronidase gene (uidA). Sequences of E. coli were obtained in 8 patients, DNA of Pseudomonas was found 5 patients, 2 patients for Citrobacter sp. and 2 for Klebsiella sp by direct sequence analysis of 17 samlpes.

3. By PCR analysis, 4 (6.8%) of 58 gallstones, 6 (12.5%) of 48 bile and 5 of 46 gallbladder mucosa were positive for Helicobacter sp.

4. Amplified Helicobacter DNA were revealed as H. pylori by PCR with H. pylori 26 kDa surface Ag in all of 4 gallstones, 5 of 6 bile, and 3 of 5 gallbladder mucosa. Direct sequencing of Helicobacter amplicons represented strains of H. pylori in all of 4 gallstones, 5 of 6 bile, and 3 of 5 gallbladder mucosa. However other hepatic Helicobacter sp. were not detected in gallstones, bile or gallbladder mucosa.

From these results, most mixed cholesterol gallstones harbor bacterial DNA and E. coli was predominant strain. The actual role of bacteria in gallstone formation warrants further study. In some portion of gallstones, bile and gallbladder mucosa, H. pylori were identified. However other hepatic Helicobacter sp. were not detected. The route of transmission or the pathogenetic role of Helicobacter sp. in gallstone diseases will be elucidated.